Janus等离子体聚集诱导发射纳米珠作为免疫层析测定的高性能比色荧光探针，用于超灵敏检测牛奶中葡萄球菌肠毒素B

金黄色葡萄球菌（S.aureus）引起的食物中毒是全球性的食品安全问题，快速、灵敏地检测其产生的主要毒力因子葡萄球菌肠毒素B（SEB）至关重要。免疫层析分析法（ICA）凭借其快速简便的优势，成为SEB检测的理想选择。然而，传统的胶体金ICA灵敏度有限。为了提高检测灵敏度，研究人员开发了多种多模态ICA平台，例如比色-荧光、比色-拉曼和比色-磁性ICA。其中，基于比色-荧光纳米复合材料（cf-HBNs）的ICA显示出巨大潜力。然而，现有的cf-HBNs存在荧光猝灭和发光强度受限等问题，限制了其进一步应用。因此，开发高性能的cf-HBNs对于提高ICA灵敏度仍然是一个挑战。

基于此，南昌大学的研究人员利用聚集诱导发光材料（AIEgens）在聚集状态下具有高发光效率的特点，将其与油胺包覆的金纳米颗粒（OA-AuNPs）进行有序自组装，构建了一种新型Janus结构的比色-荧光杂化双功能纳米球（J-cf-HBNs）。这种独特的结构使AIEgens集中在核心区域，而AuNPs则分布在外壳的特定部位，最大程度地减少了FRET和IFE，从而保留了AIEgens的高发光效率，并增强了比色信号。将J-cf-HBNs作为双功能信号探针，结合高亲和力抗体，构建了一种双模式免疫层析分析（ICA）平台，用于牛奶中SEB的快速、灵敏检测（图1）。结果表明，该平台不仅能够通过肉眼直接观察到结果，还能利用条带读取器进行定量分析，且灵敏度和准确度均优于传统的ELISA方法，为食品安全和其他领域的多模式ICA检测提供了新思路。

图1（A）J-cf-HBNs的合成原理图和（B）三明治格式超灵敏检测SEB的比色-荧光双模J-cf-HBNs-ica平台的构建。

研究人员采用一锅微乳化法成功制备了具有Janus结构的比色-荧光杂化双功能纳米球（J-cf-HBNs）。该合成过程利用了油胺包覆的金纳米颗粒（OAL-AuNPs）和聚集诱导发光材料（AIEgens）的自组装。透射电镜（TEM）图像显示，J-cf-HBNs呈现出明显的核-壳结构，其中AIEgens聚集在核心，而OAL-AuNPs则集中分布在壳层的一侧，形成Janus结构。研究人员通过对比实验，阐明了Janus结构的形成机理。他们发现，OAL-AuNPs表面油胺配体的密度对其在聚合物基质中的分布起着关键作用。低密度的油胺配体不足以分散OAL-AuNPs，导致其在PMAO聚合物中聚集，最终形成Janus结构。能量色散X射线光谱（EDX）元素mapping和线扫描分析证实了J-cf-HBNs中Au元素的不对称分布，进一步支持了Janus结构的形成。此外，X射线衍射（XRD）和X射线光电子能谱（XPS）分析也证实了OAL-AuNPs成功地掺杂到了J-cf-HBNs中。总而言之，研究人员通过精确控制材料的自组装过程，成功制备了具有预期结构和组成的J-cf-HBNs，为后续构建高性能生物传感器奠定了基础。

图2（A）J-cf-HBNs的SEM图像。（B）J-cf-HBNs的TEM图像。（C）AIENBs（a）、d-cf-hbns（b）、OAL-AuNBs（C）和OAH-AuNBs（d）的TEM图像。（d）C、N、Au在J-cf-HBNs上的EDX元素映射图像以及C、N、Au信号的叠加图像。（E）J-cf-HBNs的EDX线扫描。（F）J-cf-HBNs的XPS和（G）XRD分析。

研究人员通过紫外-可见吸收光谱和荧光光谱对J-cf-HBNs的光学性能进行了研究。结果表明，J-cf-HBNs结合了OAL-AuNPs和AIENBs的光学特性，在可见光范围内表现出更强的光吸收，并呈现出砖红色。与单独的AIENBs相比，J-cf-HBNs保留了更高的荧光强度（78%），而D-cf-HBNs仅保留了53%。荧光寿命测试结果显示，J-cf-HBNs与AIENBs具有相似的荧光寿命，表明OAL-AuNPs对AIEgens的FRET影响可以忽略不计。J-cf-HBNs的Janus结构有效地减少了FRET和IFE，从而提高了其荧光性能。为了进一步评估J-cf-HBNs的应用潜力，研究人员将其与其他纳米材料进行了比较，发现J-cf-HBNs在相同浓度下表现出更强的比色信号和更低的检测限。此外，通过比较J-cf-HBNs在比色和荧光模式下的灵敏度，研究人员发现荧光模式的灵敏度远高于比色模式，这表明J-cf-HBNs作为双功能探针可以通过采集荧光信号获得更高的灵敏度。

图3（A）OAL-AuNPs、OAL-AuNBs、AIENBs和J-cf-HBNs的紫外-可见吸收光谱。（B）AIENBs、J-cf-HBNs和D-cf-HBNs的荧光发射光谱（λex：365 nm）。（C）AIENBs和J-cf-HBNs的荧光寿命。（D）AIENBs和J-cf-HBNs在不同颗粒浓度下的荧光照片。（E）不同浓度AIENBs和J-cf-HBNs喷在纸条上的荧光强度。（F）不同颗粒浓度下AIEnb、J-cf-HBNs和胶体金的照片。（G）不同浓度AIENBs、J-cf-HBNs和胶体金喷在纸条上的光密度。

研究人员制备了两株单克隆抗体（mAb-15H11和mAb-5D6），并对其进行了表征。SDS-PAGE和抗体亚型分析表明，这两株抗体均为IgG1亚型，且纯度较高。间接ELISA分析显示，mAb-15H11和mAb-5D6对SEB具有高亲和力，且与其他常见肠毒素无明显交叉反应。为了制备J-cf-HBN@mAbs探针，研究人员采用EDC介导的共价偶联方法，将mAb-5D6连接到J-cf-HBNs表面。通过优化偶联条件，包括pH值、EDC和抗体浓度，最终获得了具有最佳生物活性的J-cf-HBN@mAbs探针。动态光散射（DLS）和Zeta电位分析结果表明，抗体成功偶联到了J-cf-HBNs表面。此外，荧光光谱分析表明，抗体偶联过程对J-cf-HBNs的发光特性没有显著影响。

研究人员利用制备的mAb-15H11和抗小鼠抗体分别作为测试线（T线）和控制线（C线）的捕获抗体，构建了比色和荧光双模式ICA试纸条。为了获得最佳的检测性能，他们对T线上mAb-15H11的浓度以及J-cf-HBN@mAbs的用量进行了优化。结果显示，当T线上mAb-15H11的浓度为1.5 mg/mL，J-cf-HBN@mAbs的用量为1.0μg/条时，可以获得最佳的荧光和比色信号。此外，他们还对试纸条的免疫反应时间进行了优化，发现15分钟的免疫反应时间可以使荧光信号达到平衡，因此将其作为所有测试的信号读取时间点。

研究人员开发了一种基于J-cf-HBNs的免疫层析分析（ICA）方法，用于检测全脂牛奶中的葡萄球菌肠毒素B（SEB）。他们首先在最佳检测条件下，制备了一系列SEB标准溶液，浓度范围从0.02到400 ng/mL。通过肉眼观察比色信号和条带读取器记录荧光信号，他们评估了该方法的性能。结果显示，该方法在比色模式下的检测限（LOD）为1.56 ng/mL，而在荧光模式下的LOD为0.09 ng/mL，远低于大多数已报道的方法。研究人员还通过分析60份SEB阴性和阳性样品，证实了该方法在检测低浓度SEB时具有出色的准确性，没有出现假阳性或假阴性结果。为评估方法的特异性，研究人员测试了J-cf-HBN-ICA对其他常见肠毒素的交叉反应性。结果表明，该方法对SEB具有优异的选择性。此外，与传统ELISA方法相比，J-cf-HBNs-ICA的LOD低近139倍，显示出显著提高的灵敏度。研究人员还评估了该方法的精密度和准确度。通过测量不同浓度的SEB样品，他们发现平均回收率在86.02%到115%之间，变异系数均小于15%，表明该方法具有满意的准确度和精密度。最后，研究人员探讨了该方法在实际样品中的应用。他们分析了SEB强化原料奶和脱脂奶样品，结果显示平均回收率在95.03%到111.03%之间，变异系数小于15%，证明了该方法在各种液态奶样品中检测SEB的通用性。

图4J-cf-HBNs-ICA检测全脂牛奶中SEB的性能评价（A）J-cf-HBNs-ICA条对全脂牛奶中不同SEB浓度的比色和荧光立体图。（B）不同SEB浓度下J-cf-HBNs-ICA检测全脂牛奶中SEB的荧光标准曲线。（C）通过测量60份SEB浓度分别为0和0.09 ng/mL的全脂牛奶样品，评价J-cf-HBNs-ICA的重复性。（D）J-cf-HBNs-ICA平台对SEA、SEB、SEC、SED和SEE等多种被检物种的特异性。

本研究成功开发了一种基于DNA条形码肽功能化金纳米颗粒的新型双模检测平台。该平台利用GPD探针的模块化结构，通过改变肽底物和DNA序列，实现了基于活性的蛋白酶多重检测。由于DNA序列的高度可编码性，该策略有望实现前所未有规模的多重检测。创新性地将CRISPR/Cas12a与DNA条形码相结合，并利用金纳米颗粒的聚集依赖性颜色变化，实现了荧光和目视双模式检测。该方法引入了基于金纳米颗粒的新型化学探针，通过双重信号放大机制显著提高了检测灵敏度。在室温下，荧光检测限低至58pM，并可实现蛋白酶纳摩尔浓度的目视检测。此外，研究团队成功制备了一对高亲和力的抗SEB单克隆抗体，亲和常数分别为2.08×10⁹M和1.81×10⁹M。基于这些抗体和高性能的GPD探针，构建了夹心型检测平台。该平台在现场裸眼可视化检测中对SEB的定性检测限为1.56 ng/mL，在牛奶样品中的定量检测限为0.09 ng/mL，灵敏度比常规ELISA提高了139倍。该检测平台在各种乳基质中展现出优异的分析性能，具有良好的准确度和精密度。这项研究为设计高性能双模纳米探针提供了新思路，在食品安全检测领域具有广阔的应用前景，特别适用于资源有限条件下的即时疾病检测。

论文链接：https：//doi.org/10.1016/j.bios.2024.116458