双面结构比色和荧光纳米复合材料与高度发光保留，以提高点护理诊断

双模式侧流免疫分析法（LFIA）由于其结合了比色和荧光信号的优势，近年来备受关注，为实现高灵敏度和定量检测提供了可能。然而，现有的比色-荧光纳米复合材料（cf-NCs）由于金纳米颗粒（AuNPs）和发光组分之间存在显著的空间交叉，导致荧光共振能量转移或内部滤光效应，降低了荧光强度，限制了检测灵敏度。尽管Janus纳米结构可以减少AuNPs与发光组分的空间交集，但目前仍然缺乏将AuNPs与聚集诱导发光材料（AIEgens）结合构建具有Janus结构的cf-NCs，用于高性能双模式LFIA的研究。

基于此，南昌大学的研究者提出了一种新型的双模检测平台，称为DNA条形码光学纳米结构蛋白酶活性传感器。如图1A所示，该传感器由以下关键组件构成：DNA条形码肽：将肽作为蛋白酶底物，在其C端和N端分别标记半胱氨酸和叠氮赖氨酸，然后通过无铜点击化学方法与DBCO修饰的寡核苷酸结合。金-肽-DNA（GPD）混合探针：将DNA条形码肽功能化到柠檬酸盐包被的金纳米颗粒上。CRISPR/Cas12a检测系统：用于检测溶液中释放的DNA条形码。检测过程如下：蛋白酶切割GPDs上的底物，释放DNA条形码到溶液中。通过离心去除AuNPs后，DNA条形码与gRNA结合并激活Cas12a。激活的Cas12a切割荧光团-淬灭剂标记的单链DNA序列，产生荧光信号（图1B）。

图1（A）J-cf-NCs、CS-cf-NCs和CE-cf-NCs的合成示意图。（B）J-cf-NCs，（C）CS-cf-NCs，（D）CE-cf-NCs的TEM图像。（E）HAADF-STEMEDS元素图，（F）EDS元素线扫描结果，（G）粉末x射线衍射图，（H）j-cf-nc的XPS分析。

研究人员利用一锅微乳化法制备了三种不同结构的比色-荧光纳米复合材料（cf-NCs），分别为Janus结构（J-cf-NCs）、核壳结构（CS-cf-NCs）和共嵌入结构（CE-cf-NCs）。J-cf-NCs由疏水性金纳米颗粒（OAL-AuNPs）和聚集诱导发光材料（GAIEgens）在聚马来酸酐-1-十八烯（PMAO）基质中自组装形成，其中OAL-AuNPs聚集在PMAO壳层的一侧，呈现出明显的Janus结构。CS-cf-NCs采用疏水性更强的金纳米颗粒（OAH-AuNPs）与GAIEgens和PMAO组装而成，OAH-AuNPs均匀分布在PMAO壳层中，形成核壳结构。而CE-cf-NCs则以DSPE-PEG2000为基质，GAIEgens和OAH-AuNPs随机共嵌入其中。通过利用扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）等技术对三种不同结构的cf-NCs的形态、结构和水力学直径进行了表征。SEM图像显示，三种cf-NCs均呈现均匀的球形，但J-cf-NCs表现出明显的不对称性，AuNPs聚集在球体的一侧。TEM图像进一步证实了J-cf-NCs的Janus结构，其中AIEgens形成核心，包裹在PMAO壳层内，而AuNPs则聚集在PMAO壳层的一侧。CS-cf-NCs呈现出典型的核壳结构，而CE-cf-NCs则呈现出AuNPs和AIEgens随机分布的共嵌入结构。EDS和XPS分析进一步证实了三种cf-NCs的元素组成和空间分布。

研究人员通过比较J-cf-NCs、CS-cf-NCs和CE-cf-NCs的紫外可见光谱和荧光光谱，评估了三种结构cf-NCs的光学性能。结果显示，J-cf-NCs的SPR吸收峰发生了红移，这可能是由于OAL-AuNPs的聚集导致的。与单独的GAIEgens相比，J-cf-NCs、CS-cf-NCs和CE-cf-NCs分别保留了75%、50%和15%的荧光强度，表明J-cf-NCs具有最高的荧光保留率。瞬态-稳态荧光光谱分析表明，J-cf-NCs和CS-cf-NCs的荧光寿命与GAIEgens相似，说明Janus和核壳结构有效地阻止了FRET引起的荧光猝灭。相比之下，CE-cf-NCs的荧光寿命较短，表明AuNPs和GAIEgens之间存在FRET相互作用，导致荧光猝灭。

进一步的研究表明，J-cf-NCs的比色信号强度随着OAL-AuNP含量的增加而增强，但过高的OAL-AuNP含量会导致J-cf-NCs尺寸过大，不利于其在硝化纤维素膜上的流动。通过比较三种cf-NCs在硝化纤维素膜上的比色和荧光性能，发现J-cf-NCs在相同浓度下表现出更强的信号强度，说明其具有更高的灵敏度。最后，研究人员还考察了J-cf-NCs在不同pH条件、盐浓度和样品基质下的光学稳定性。结果表明，J-cf-NCs具有优异的光学性能和稳定性，可以作为构建双模LFIA平台的理想探针。

图2（A）unbs、J-cf-NCs、CS-cf-NCs、CE-cf-NCs和GAIENBs的紫外可见光谱。（B）GAIENBs、J-cf-NCs、CS-cf-NCs和CE-cf-NCs的荧光发射光谱；激发光为365 nm。（C）GAIENBS、J-cf-NCs、CS-cf-NCs和CE-cf-NCs的瞬态稳态荧光光谱（D-E）不同OAL-AuNP含量的J-cf-NCs的紫外-可见光谱和流体动力直径分布。（F）不同浓度的J-cf-NCs、CS-cf-NCs和CE-cf-NCs在NC膜上自然光和365 nm UV光照下的物理图像，红色标记表示灵敏度最低。

研究人员利用制备的J-cf-NCs作为双功能探针，构建了一种基于夹心结构的双模式侧向免疫层析分析平台（J-cf-NC-LFIA），并以C反应蛋白（CRP）作为模型分析物验证了该平台的性能。该平台的工作原理如下：当目标分析物CRP存在时，它首先与J-cf-NCs@mAb探针结合，形成免疫复合物。该复合物在试纸条上层析，并被固定在测试线（T线）上的抗CRP抗体捕获，形成三明治结构。过量的探针则在控制线（C线）上与山羊抗小鼠IgG抗体结合。

通过肉眼观察T线上的颜色变化可以定性检测CRP，而通过读取T线上的荧光信号强度可以定量检测CRP。结果显示，J-cf-NC-LFIA对CRP的视觉检测限为3.9 ng/mL，远低于传统胶体金试纸条的31.25 ng/mL。此外，J-cf-NC-LFIA在荧光模式下表现出更高的灵敏度，检测限可达0.038 ng/mL，动态线性范围为0.061-500 ng/mL。选择性实验表明，J-cf-NC-LFIA对CRP具有高度选择性。回收率和变异系数分析表明，J-cf-NC-LFIA具有良好的准确度和精密度。

进一步地，研究人员利用该平台对临床血清样本进行了检测。结果显示，J-cf-NC-LFIA的检测结果与化学发光免疫分析法（CLIA）的结果高度一致，证明了该平台在实际样品检测中的可靠性和准确性。

图3（A）J-cf-NC-LFIA检测CRP的原理。（B）J-cf-NC-LFIA试纸的比色和荧光图像。（C）基于J-cf-NC-LFIA的标准加标人血清样品CRP检测定量分析，CRP浓度范围为0-3000 ng/mL。（D）通过测量J-cfNC-LFIA对其他常见干扰蛋白的信号反应来评估其对CRP的特异性。（E）CRP浓度为0和0.040 ng/mL时，J-cf-NC-LFIA的检测精度。（F）J-cf-NCs-LFIA法与商用CLIA试剂盒检测37份CRP阳性人血清中CRP检测浓度的相关性分析。

为了验证该Janus结构纳米复合材料（J-cf-NCs）在小分子检测中的应用潜力，研究人员构建了一种竞争性J-cf-NC-LFIA平台，用于检测牛奶中的黄曲霉毒素M1（AFM1）。该竞争性J-cf-NC-LFIA的原理是：当样品中不存在AFM1时，J-cf-NCs探针会被固定在测试线（T线）上的竞争抗原捕获，产生强荧光信号；而当样品中存在AFM1时，J-cf-NCs探针上的抗体会被AFM1占据，导致T线上的荧光信号强度与AFM1浓度呈反比。

研究人员对该平台的检测性能进行了系统优化，并在最佳条件下对不同浓度的AFM1进行了检测。结果显示，该平台对AFM1的视觉检测限为0.5 ng/mL。通过分析荧光信号，该平台的定量检测限可达0.008 ng/mL，灵敏度比肉眼观察提高了38倍。

特异性实验表明，该平台对AFM1具有高度特异性，与其他常见牛奶添加剂没有交叉反应。回收率和变异系数分析表明，该平台具有良好的准确度和精密度。此外，研究人员还将该平台与商业ELISA试剂盒进行了比较，结果显示两种方法的检测结果高度一致，证明了该平台在实际样品检测中的可靠性和准确性。最后，研究人员还证实了该平台适用于不同类型牛奶样品（包括全脂牛奶和巴氏杀菌牛奶）中AFM1的检测，进一步证明了该平台的实用价值。

图4（A）J-cf-NC-LFIA检测AFM1的原理。（B）J-cf-NC-LFIA试纸的比色和荧光图像。（C）基于J-cf-NC-LFIA的标准加标脱脂牛奶中AFM1的定量分析，AFM1浓度范围为0-32 ng/mL。（D）通过测定J-cf-NC-LFIA对其他非法添加剂的信号响应来评价其对AFM1的特异性。（E）J-cf-NC-LFIA法与商用ELISA试剂盒检测36份脱脂牛奶中AFM1浓度的相关性分析。

本研究成功开发了一种基于Janus结构的比色-荧光纳米复合材料（J-cf-NCs），用于构建高性能的双读出侧流免疫分析法（LFIA）平台。J-cf-NCs由疏水性金纳米颗粒（AuNPs）和聚集诱导发光材料（GAIEgens）组成，其独特的Janus结构最大程度地减少了AuNPs和GAIEgens之间的空间交叉，有效避免了荧光共振能量转移（FRET）和内部滤光效应（IFE），从而实现了更高的荧光保留率。研究人员将J-cf-NCs作为双功能探针，构建了夹心式和竞争式两种双读出LFIA平台，并分别以C反应蛋白（CRP）和黄曲霉毒素M1（AFM1）作为模型分析物，验证了该平台的检测性能。结果表明，相比于传统的胶体金试纸条，基于J-cf-NCs的LFIA平台对CRP和AFM1的检测灵敏度显著提高，展示出巨大的应用潜力。该研究为高性能比色-荧光探针的制备提供了新思路，并为开发高灵敏度、高特异性的生物传感器提供了新的平台。

论文链接：https：//doi.org/10.1016/j.cej.2024.154825