引言

随着现代农业的发展，有机磷农药(OPPs)被广泛应用于病虫害防治中,以提高农作物的产量。但是,这也导致OPPs在土壤、水体、农产品中的残留不断积累,给食品安全带来了严重隐患。因此,迫切需要开发一种快速直观的识别策略,能同时检测多种OPPs同系物。

传统的分析技术如液相色谱、气相色谱、质谱等具有高灵敏度和选择性,但仪器昂贵、操作复杂,难以实现现场快速检测。基于酶抑制的比色法能够利用酶催化底物产生的染色信号,具有操作简单、成本低廉的优势。但是,由于这类检测信号主要来自于亮度变化,难以被肉眼准确识别。相比之下,利用颜色变化作为检测信号更加直观和敏感。

近年来,贵金属纳米材料优异的光学性能为比色传感器阵列的发展带来了新思路。其中,金纳米双锥体(Au NBPs)表现出可调的局域表面等离子共振特性,能根据长径比的变化而引发溶液颜色的可视化变化。此外,利用智能设备将溶液颜色信号数字化,进一步提高了检测的灵敏度和重复性。

本文设计并构建了一种双酶级联诱导的比色传感器阵列,用于OPPs同系物的可视化检测。该方法利用锰氧化物纳米花(MnO₂ NFs)催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)氧化产生TMB²⁺,从而腐蚀Au NBPs并引发溶液颜色变化。同时,碱性磷酸酶(ALP)水解L-抗坏血酸2-磷酸镁(AAP)生成抗坏血酸(AA),抑制MnO₂ NFs的氧化活性,从而防止Au NBPs的进一步腐蚀。受OPPs的影响,ALP的催化活性下降,导致AA生成减少,最终引起Au NBPs的不同程度腐蚀,产生多彩的颜色变化。通过结合UV-vis吸收光谱和溶液RGB数字信号,采用主成分分析(PCA)方法能够直观地区分不同OPPs同系物。该比色阵列还成功应用于茶叶、苹果和白菜等实际食品样品的OPPs检测。

结果与讨论

1. MnO₂ NFs的催化性能及机理验证

MnO₂纳米材料表现出类酶的催化活性,可用于替代生物酶。其中,MnO₂纳米花(MnO₂ NFs)由于独特的花状结构、大比表面积和高活性位点,展现出优异的催化性能。合成得到的MnO₂ NFs具有均一的花状形貌,平均粒径约600 nm。XRD分析表明其具有稳定的正交晶系结构。MnO₂ NFs在水中分散稳定,经过20个月的储存仍保持86.3%的催化活性,表明其优异的稳定性。

进一步验证了MnO₂ NFs作为氧化酶模拟剂催化TMB氧化的机理。首先,MnO₂ NFs能够将无色的TMB氧化为蓝色的TMB⁺,并在酸性环境下进一步转化为黄色的TMB²⁺。通过实验表明,该过程需要溶解氧的参与,产生了超氧自由基和单线态氧,但未检测到羟自由基。因此,MnO₂ NFs可以催化溶解氧氧化为超氧自由基和单线态氧。这些活性氧自由基参与了TMB的连续氧化反应。

2. Au NBPs的腐蚀特性及其抑制机理

Au NBPs呈现出明显的纵向和横向两个局域表面等离子体共振峰,并展现出稳定的尖锐针状结构。TMB²⁺具有强氧化性,能够引发Au NBPs的腐蚀,导致其长径比降低,从而引起溶液颜色的可视化变化。而TMB和TMB⁺本身无法腐蚀Au NBPs。

另一方面,抗坏血酸(AA)能够还原MnO₂ NFs至Mn²⁺,从而抑制其催化TMB的氧化活性,进而阻止Au NBPs的腐蚀。实验证明,AA正是由ALP催化AAP水解产生的,OPPs通过抑制ALP的催化活性,从而减少AA的生成,最终影响Au NBPs的腐蚀程度。随着AA浓度的增加,Au NBPs的腐蚀逐渐被抑制,呈现出由粉红、紫色、蓝色、绿色、灰色到粉红的颜色变化。

3. 单一OPP的比色分析

针对5种典型的OPPs,包括二氯松、毒死蜱、对硫磷、敌敌畏和三氯杀螨醇,采用优化的反应条件对其进行单一检测。结果发现,不同OPPs对ALP的抑制作用不同,导致Au NBPs的腐蚀程度和颜色变化各异。以二氯松为例,在0.81-6.46 μM的线性范围内,其浓度增加导致Au NBPs纵向峰蓝移从604 nm至753 nm,同时溶液颜色从棕色变为灰色、绿色、蓝色和紫色。检出限为0.47 μM,回收率在95.00%-105.00%之间。分别对毒死蜱、对硫磷、三氯杀螨醇和敌敌畏进行了相同的测试,结果均优良,符合相关的标准要求。

此外,利用光谱信号和颜色数字信号构建PCA模型,能够有效地区分同一OPP在不同浓度下的检测结果。层次聚类分析(HCA)进一步验证了该方法在单一OPP定量检测中的可靠性和重复性。上述结果表明,该方法不仅能检出目标OPPs,还可定量分析其浓度,为OPPs在环境样品中的检测提供了新的分析手段。

4. OPPs同系物的比色识别

为了模拟实际环境中OPPs的复杂性,我们评估了二种OPPs的二元混合体系。以毒死蜱和敌敌畏为例,通过改变两者的混合比例(1:0、3:1、1:1、1:3、0:1),考察传感器阵列的识别能力。结果显示,不同比例的OPPs混合物能形成明显分离的聚类,PCA图能够直观地区分出五类不同的OPPs混合样品。

结论

本研究提出了一种利用双酶级联系统来识别OPPs同源物的比色阵列。ALP与AAP反应生成AA，抑制了MnO₂ NFs对Au NBPs的氧化。根据OPPs的类型，对ALP活性的抑制作用可能不同。或者，在Au NBPs上的蚀刻效果可能相对不同，从而导致颜色的明显变化。根据Au NBPs的LSPR和RGB转换的变化，这些变化被转换成数字信号。此外，PCA和HCA相结合可以更精确地区分和识别各种OPPs同系物。MnO₂ NFs与ALP之间的酶级联反应提高了检测的灵敏度和稳定性。该比色阵列已被证明可以在茶叶、苹果和卷心菜等实际样品中识别OPPs同系物。然而，在本研究中，未知样本的量化仍然具有挑战性，需要进一步的研究来建立一个包含其他OPPs的综合数据库。随着这些数据库的建立和先进的数据处理技术，研究人员将更好地了解与OPPs相关的毒理学风险。它将使农药的广谱筛选和定量成为可能。

参考文献

Chen, Z.; Li, M.; Chen, W.; Zhou, J.; Gu, X.; Ding, C.; Huang, Y., Cascade reaction triggered colorimetric array for identification of organophosphorus pesticides congeners. Biosens. Bioelectron. 2024, 253, 116143.