引言

病原体每年造成数百万人死亡,是人类健康面临的最大威胁之一。传统的病原体检测方法,如细菌培养、免疫层析分析和PCR等,虽然都是金标准,但存在操作繁琐、时间长、灵敏度较低等缺点,限制了它们在现场快速检测的应用。因此,开发一种简单、快速、灵敏的新型检测方法对于提高病原体的监测和控制至关重要。

近年来,核酸适配体作为分子探针在食品安全监测、疾病诊断等领域受到广泛关注。相比于传统的抗体,适配体具有更强的亲和力、更低的成本和更高的稳定性等优势。然而,单价适配体通常与目标细菌的亲和力较低,需要1-2小时的反应时间。为了提高适配体的性能,研究人员设计了多价适配体,利用核酸自组装技术构建了多支链、多分支的DNA/RNA结构,从而大大提升了适配体与目标细菌的亲和力和结合动力学。这种多价适配体在细胞和病毒检测中展现出了优异的性能。然而,将多价适配体应用于病原体检测的报道还较少。

与此同时,基于金属纳米酶的侧流检测技术也引起了广泛关注。金属纳米酶具有高催化活性、高稳定性和低成本等优点,在侧流检测中表现出了出色的信号放大能力。其中,基于磁性纳米酶的检测方法因具有分离富集和比色检测的双重功能而备受青睐。但是,金属纳米酶很少在基于适配体的侧流检测中得到应用。

综上所述,本文旨在设计一种基于多价适配体和多功能磁性纳米酶的快速超灵敏侧流检测方法(MA-MN LFA),以金黄色葡萄球菌(S. aureus)为模型目标细菌进行验证。首先,通过巧妙设计构建了具有高亲和力的多价适配体(HCR-multi-Apt);然后合成了一种具有磁性分离、富集和比色放大功能的Fe₃O₄@MOF@PtPd纳米酶。最后将上述两种关键材料集成于侧流检测平台上,成功建立了一种快速、灵敏的MA-MN LFA传感器。该方法不仅检测灵敏度高,而且检测时间短,操作简单,可广泛应用于金属阳性细菌的检测,为病原体监测提供了一种强有力的工具。

结果与讨论

1. 多价适配体的设计与构建

为了提高适配体的亲和力和结合动力学性能,本研究通过巧妙设计构建了一种基于杂交链反应(HCR)的多价适配体(HCR-multi-Apt)。如Scheme 1A所示,HCR-multi-Apt的构建包括两个步骤:首先,使用两种生物素标记的发夹DNA(H1和H2)通过HCR自组装形成多支链、多分支的DNA支架;然后,将生物素修饰的延伸适配体(Bio-exApt)与HCR产物杂交,获得最终的HCR-multi-Apt。其中,H1上的突出结构能够与Bio-exApt杂交,从而将适配体整合到多支链DNA支架上。这种巧妙的设计不仅可以提高适配体的亲和力,而且能够缩短反应时间,实现快速检测。

2. 多功能磁性纳米酶的构建

采用分步法合成了具有多功能的Fe₃O₄@MOF@PtPd纳米酶。首先,通过溶剂热反应制备了羧基化的Fe₃O₄纳米颗粒,TEM和SEM图像显示Fe₃O₄纳米颗粒尺寸均一,粒径约为235 ± 12 nm。接下来,将Fe₃O₄纳米颗粒用作核心,通过一锅法合成方法生长MIL-100(Fe)外壳,形成Fe₃O₄@MOF核壳结构。TEM和SEM图像表明,经过5个生长周期,Fe₃O₄纳米颗粒表面形成约50 ± 5 nm厚的MIL-100(Fe)外壳。最后,将PtPd纳米立方体(PtPd NCs)吸附在Fe₃O₄@MOF表面,得到了Fe₃O₄@MOF@PtPd复合纳米酶。TEM和SEM图像显示,高密度的PtPd NCs均匀分布在Fe₃O₄@MOF表面。元素面扫描进一步证实了Fe、C、O、Pt和Pd元素在Fe₃O₄@MOF@PtPd中的有序分布,XRD分析也验证了该核壳结构的形成。此外,Fe₃O₄@MOF@PtPd表现出良好的磁性,可用于磁性分离和富集目标细菌。

3. MA-MN LFA的检测原理与性能评价

如Scheme 1B所示,当含有金黄色葡萄球菌的样品加入时,Van修饰的Fe₃O₄@MOF@PtPd和HCR-multi-Apt能够同时识别和捕获目标细菌,形成三元络合物。该络合物迁移至试纸条上的T线后,生物素与亲和素的相互作用将其固定。同时,未结合的纳米探针也能通过cDNA与C线上的探针杂交而被捕获。由于Fe₃O₄@MOF@PtPd的富集,T线和C线将出现两条鲜明的颜色条带。此外,通过立即催化显色液,可以进一步放大纳米探针在T线和C线的信号。整个检测过程只需30 min即可完成,且目标细菌浓度与T线信号强度呈正相关,可实现定量检测。

为评价MA-MN LFA的性能,作者首先优化了各关键参数,包括HCR-multi-Apt浓度、纳米探针用量、反应时间等。结果显示,在最优条件下,MA-MN LFA可检测到2 CFU/mL的S. aureus,并且检测范围宽达10-10⁸ CFU/mL,远优于常规的免疫层析法。此外,我们还在牛奶样品中进行了回收率实验,结果显示回收率在91.3%-105.6%之间,验证了该方法在实际样品分析中的应用潜力。

结论

本文设计并构建了一种基于多价适配体和多功能磁性纳米酶的快速超灵敏侧流检测方法(MA-MN LFA),用于金黄色葡萄球菌的检测。通过巧妙设计的HCR-multi-Apt和Fe₃O₄@MOF@PtPd纳米探针,该方法实现了目标细菌的快速分离富集和灵敏信号放大,检测限达2 CFU/mL,检测时间仅30 min,且适用于复杂实际样品。该研究不仅为病原体的快速检测提供了一种新颖的技术方案,也为多价适配体在生物传感领域的应用开拓了新的可能。未来,可以进一步优化该检测平台,并将其推广至更多种类的病原体检测中,为食品安全监测和疾病诊断提供有力支撑。

参考文献

Li, X.; Li, G.; Pan, Q.; Xue, F.; Wang, Z.; Peng, C., Rapid and ultra-sensitive lateral flow assay for pathogens based on multivalent aptamer and magnetic nanozyme. Biosens. Bioelectron. 2024, 250, 116044.