纳米催化剂触发的级联免疫分析：用于敏感检测鼠伤寒沙门氏菌的多模型免疫层

食源性病原体引发的传染病对公众健康构成严重威胁，沙门氏菌感染是最常见的食源性疾病之一，每年影响数百万人，症状包括发热、头痛、恶心、呕吐、腹痛和腹泻。鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）是全球引发食源性疾病的主要血清型，早期检测其存在至关重要。免疫层析法（ICA）因其操作简便、成本低廉而广泛应用于护理点检测，但传统的胶体金比色ICA主要提供定性结果。为提高检测灵敏度，研究者们探索了结合表面增强拉曼光谱、光热信号和磁信号的新策略，实现定量分析。纳米酶的应用在比色法和光热免疫分析中显示出高灵敏度，且其固有的酶催化活性可增强信号输出。三明治ICA作为一种重要检测方法，通常结合靶再富集和信号放大策略来提升灵敏度，但其实施需要专业技术和设备。尽管已有多种新型探针和方法被提出，如何有效设计纳米酶介导的级联扩增机制，实现对靶标的定量分析仍然是当前研究的挑战。

基于此，西北农林科技大学的研究者提出了一种PtNiCo@tannic酸（TA）纳米信号标记，用于纳米酶触发的多模型ICA检测鼠伤寒沙门氏菌。方案1a描述了基于PtNiCo@TA的免疫层析法（ICA）结构，采用双抗体夹心免疫分析法检测鼠伤寒沙门氏菌。在目标菌存在的情况下，PtNiCo@TA纳米信号探针首先捕获鼠伤寒杆菌，形成免疫复合物。通过毛细作用，固定在测试线上的抗体进一步与免疫复合物结合，形成夹心复合物。剩余探针则与C线上的山羊抗小鼠IgG反应。检测完成后，测试条的T线区域被浸入含有TMB和H₂O₂的缓冲液中，通过PtNiCo@TA的酶催化放大比色信号，5分钟后可被读取。随后，产物oxTMB在近红外激光的作用下，表现出更强的催化信号和光热效应，实现了灵敏的定量检测。该系统集成了比色、催化和光热信号，能够有效检测鼠伤寒沙门氏菌。

方案1。（a） PtNiCo@TA-based双抗体夹心ICA结构示意图。（b）多模信号输出示意图。（c）鼠伤寒沙门氏菌多模式NTCI检测原理。

通过溶剂热法，利用Pt（acac）₂、Co（acac）₃和Ni（CH3COO）₂作为金属源成功制备了PtNiCo纳米酶。透射电子显微镜（TEM）表明，合成的纳米酶呈现花状结构，表面粗糙，提供了更多的催化活性位点。进一步的X射线光电子能谱（XPS）分析显示，PtNiCo纳米酶的Pt 4f峰位于71.7 eV和75.0 eV，表明合金的成功形成，并揭示了合金化对Pt电子结构的影响。与纯Pt相比，PtNiCo的d带中心减小，表明Ni和Co原子对Pt的电子结构进行了修饰。此外，TA被引入以提高PtNiCo纳米酶在水中的分散性，TA修饰后Zeta电位从-20.4 mV提高至-36.3 mV，显著增强了胶体稳定性。酶活性测试结果显示，PtNiCo@TA的酶活性略高于未修饰的PtNiCo，这与其良好的稳定性密切相关。

图1. PtNiCo和PtNiCo@TA的表征。（a） PtNiCo的合成过程。（b） PtNiCo的TEM图像。（c） PtNiCo@TA的TEM图像。（d， e， f） Pt、Co和Ni的XPS峰，（g） PtNiCo和PtNiCo@TA的Zeta电位。（h， i）浓度分别为0.15、0.30、0.45、0.75、0.90 μg·mL - 1，时间为0 ~ 9 min时，PtNiCo和PtNiCo@TA的活性曲线。

纳米催化剂触发的级联信号由两部分组成:在H₂O₂和TMB存在下，具有过氧化物酶模拟活性的PtNiCo@TA纳米信号标签可催化产生蓝色的oxTMB，产生比色信号。oxTMB不仅具有明显的吸收峰，而且在808 nm激光照射下表现出优异的光热性能。通过检测温度变化，可以进一步对oxTMB进行定量分析。研究发现，单独的PtNiCo@TA或TMB/H₂O₂混合物都不具有催化氧化TMB的能力，而PtNiCo@TA与TMB、H₂O₂反应后，在652 nm处出现特征吸收峰，证明其具有良好的过氧化物酶活性。同样，在808 nm激光照射下，反应产物oxTMB表现出明显的温度响应。此外，纳米酶的催化反应具有明显的信号放大效果。在450 nm处测定吸光度，PtNiCo@TA的最低检测浓度从2 μg·mL−1降至加入H₂O₂和TMB后的0.16 μg/mL。温度变化曲线也可用于表示oxTMB的量，为后续定量检测提供基础。

图2. tNiCo@TA纳米信号标签的比色、催化和光热性质。（a） PtNiCo@TA（红色）、TMB + H₂O₂（灰色）、PtNiCo@TA + TMB + H₂O₂（蓝色）的紫外可见吸收光谱图。（b） PtNiCo@TA（红色）、TMB + H₂O₂（灰色）、PtNiCo@TA + TMB + H₂O₂（蓝色）的光热变化。（c）一系列浓度PtNiCo@TA（红色）在450 nm处的吸光度，一系列浓度PtNiCo@TA + TMB + H₂O₂（蓝色）在652 nm处的吸光度，以及一系列PtNiCo@TA + TMB + H₂O₂（紫色）在808 nm处照射3 min后的温度变化。（d）不同浓度下PtNiCo@TA的比色信号。（e、f） PtNiCo@TA + TMB + H₂O₂在不同浓度下的催化光热信号。（从左至右（1-18）分别为0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36、0.40、0.80、2、4、8、20、40、80 μg/mL）。TMB浓度为0.2 mM， H2O2浓度为10 mM）。（对于图例中有关颜色的解释，请参阅本文的网页版本。）

为验证PtNiCo@TA纳米催化探针对鼠伤寒沙门氏菌的结合能力，研究者首先用anti-S修饰了纳米信号标签。通过将探针与细菌溶液充分混合，并利用扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线能谱（EDS）分析探针与鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）的结合情况。结果显示，致病菌（红圈）与纳米探针（蓝圈）结合良好，特征元素C、O、Pt、Co和Ni均匀分布在对应的区域内。这些结果表明，PtNiCo@TA纳米催化探针成功捕获了致病菌。

图3. 鼠伤寒沙门氏菌与PtNiCo@TA纳米催化探针联合的SEM。（a） SEM图像，（b） C元素，（C） O元素，（d） Pt元素，（e） Co元素，（f） Ni元素。

本研究深入探讨了基于PtNiCo@TA纳米酶的多模型免疫层析法（ICA）的关键实验因素，包括标记浓度、抗体数量和探针数量。在10⁶ cfu/mL条件下，这些因素对鼠伤寒沙门氏菌的检测影响不显著，因此选择10⁴ cfu/mL进行进一步评估。结果显示，最佳检测条件为0.2 mg/mL的PtNiCo@TA纳米酶、7 μg的单克隆抗体和7 μL的探针。在此条件下，进行比色分析，发现T线强度与细菌浓度呈正相关，第一视觉检出限为10⁴ cfu/mL，线性范围为5 × 10⁴-10⁷ cfu/mL。随后进行催化信号放大分析，催化分析的检出限为10³ cfu/mL，线性关系良好。最后，通过光热信号分析，检出限进一步降低至5 × 10² cfu/mL，线性范围扩展至5 × 10²-5 × 10⁴ cfu·mL。与比色信号相比，催化和光热信号的灵敏度分别提高了10倍和20倍，表明PtNiCo@TA纳米酶的多模型NTCI在食源性致病菌检测中具有良好的灵敏度和特异性。此外，针对多种干扰菌的实验结果显示，该检测方法对鼠伤寒沙门氏菌具有良好的特异性。

图4. PtNiCo@TA-based多模型NTCI的分析性能。（a） PtNiCo@TA-based多模式NTCI对不同浓度鼠伤寒沙门氏菌（0-10⁷ cfu/mL）响应的比色照片。（b） PtNiCo@TA-based多模型NTCI的比色灵敏度分析结果。附图为5 × 10⁴-10⁷ cfu/mL范围内鼠伤寒沙门氏菌浓度与检测线强度的校准曲线。（c） PtNiCo@TA-based多模式NTCI对不同浓度鼠伤寒沙门氏菌的催化谱，（d） PtNiCo@TA-based多模式NTCI的催化敏感性分析结果。附图为鼠伤寒沙门氏菌检测线强度与浓度在5 × 10³-5 × 10⁶ cfu/mL范围内的校准曲线。（e） PtNiCo@TA-based多模式NTCI对不同浓度鼠伤寒沙门氏菌的光热响应图像。（f） PtNiCo@TA-based多模型NTCI光热敏感性分析结果。附图为鼠伤寒沙门氏菌检测线强度与浓度在5 × 10²-5 × 10⁴ cfu/mL范围内的校准曲线。PtNiCo@TA-based多模型NTCI的比色（g）、催化（h）和光热（i）模式的分析特异性。

本研究构建了一种具有优异过氧化物酶模拟性能和比色性能的PtNiCo@TA三金属纳米酶信号标签。将单宁酸（TA）包覆在PtNiCo纳米花表面，提高了纳米标签的功能化和生物相容性。PtNiCo@TA纳米酶可催化TMB和H₂O₂生成蓝色氧化产物oxTMB，有效放大信号。在近红外激光照射下，oxTMB不仅表现出颜色变化，还具有强烈的光热效应。在此基础上，研究者构建了基于PtNiCo@TA纳米催化剂的级联免疫检测方法（NTCI），用于鼠伤寒沙门氏菌的检测。在最佳条件下，通过比色-催化-光热级联反应，检测灵敏度可达500 cfu/mL。这种基于多模型输出的NTCI可实现对目标菌的定性和定量分析。将该平台应用于脱脂牛奶中鼠伤寒沙门氏菌的回收实验，回收率达88.08%~99.41%，证明了其在食品样品中的适用性。这种级联信号放大策略拓宽了纳米酶的多信号输出能力，为高灵敏度比色免疫分析提供了新思路，为食源性致病菌的超灵敏检测提供了有前景的替代方案。

论文链接：https://doi.org/ 10.1016/j.cej.2023.143979