纳米酶辅助分子印迹聚合物间接竞争ELISA法检测海洋生物毒素

引言

海洋生物毒素蛤蚌毒素(Saxitoxin, STX)是一种高效神经毒素,可通过食用受污染的贝类等海洋生物而进入人体,造成严重的麻痹性贝毒中毒。因此,建立一种快速、灵敏、低成本的检测STX的方法对于保障食品安全和环境监测至关重要。

传统的STX检测手段,如小鼠生物测定法、液相色谱-质谱联用等,存在需要专业人员操作、时间耗费长、设备昂贵等问题。酶联免疫吸附测定法(ELISA)作为一种替代方法,因其操作简单、成本较低而广受关注。但现有的ELISA试剂盒依然需要使用抗体和毒素-酶(或载体蛋白)偶联物,存在制备复杂、稳定性较差的问题。

本研究利用AuNP/Co₃O₄@Mg/Al cLDH纳米酶，建立了一种基于亲和肽印迹聚合物的间接竞争ELISA (ic-ELISA)检测STX的平台。该平台不需要抗体和STX酶(或载体蛋白)偶联物。通过煅烧AuNP/ZIF-67@Mg/Al LDH合成AuNP/Co₃O₄@Mg/Al cLDH纳米酶。在基于MIPs的ic-ELISA中，使用STX亲和肽而不是抗体或适体作为模板，以克服与非特异性共聚或适体去除相关的挑战。在合成STX亲和肽印迹聚合物后，将c端含有生物素的STX特异性信号肽(STX SP)引入到MIPs包被的微孔板中。STX SP粘附在MIPs包被的微孔板上，然后使用链亲和素(SA)包被的纳米酶通过生物素-亲和素相互作用检测STX SP。据我们所知，提出的新型ic-ELISA系统标志着首次将亲和肽和MIPs结合起来检测小毒素，而不使用小毒素蛋白偶联物和天然酶。该方法具有成本低、使用方便、稳定性强等优点，为食品安全、环境保护、药品安全和疾病诊断提供了一种新的策略。

结果与讨论

1. 亲和肽烙印聚合物的构建

为克服使用抗体或核酸适体存在的非特异性共聚或分离问题,研究设计了一种基于亲和肽的MIP。首先,通过电化学阻抗谱分析(EIS)篮选出具有最高识别性能的STX特异性亲和肽HYPTWQAMKTTW。然后采用微接触印刷技术,将该亲和肽固定到聚二甲基硅氧烷(PDMS)模板上,并利用自由基聚合反应在96孔板上制备MIP。与未烙印的非烙印聚合物(NIP)相比,MIP显示出更优异的选择性识别能力。

2. 高活性纳米酶的合成与表征

为提供灵敏的检测信号,研究合成了一种AuNP/Co₃O₄@Mg/Al cLDH复合纳米酶。该纳米酶通过先制备AuNP/ZIF-67@Mg/Al层状双金属氢氧化物(LDH),再经过焙烧制得。表征结果显示,纳米酶具有高比表面积、优异的化学稳定性和出色的催化活性,对常用底物邻苯二胺(TMB)的Michaelis常数K_m为0.24 mM,对过氧化氢的K_m为132.5 mM,为后续ELISA检测提供了良好的信号放大平台。

3. 基于MIP和纳米酶的ic-ELISA检测STX

在MIP修饰的微孔板上,引入含有生物素标签的STX特异性信号肽(STX SP),与STX发生竞争性结合。未与STX结合的STX SP可与MIP发生结合,通过生物素-亲和素的识别,被链霉亲和素(SA)修饰的AuNP/Co₃O₄@Mg/Al cLDH纳米酶捕获,从而实现对STX浓度的间接检测。该ic-ELISA检测STX的限值达3.17 ng/mL,符合食品中STX的管控标准。

通过与商业ELISA试剂盒的比较验证,所开发的ic-ELISA在贻贝组织样品中表现出良好的STX回收率和较低的变异系数,证明了该方法在实际检测中的适用性和可靠性。

结论

该研究提出了一种新颖的基于亲和肽烙印聚合物和纳米酶的ic-ELISA检测STX的方法,具有选择性好、灵敏度高、稳定性强和操作简便等优点。该方法不需使用抗体和毒素-酶(载体蛋白)偶联物,为小分子毒素的快速、便捷检测提供了新思路,在食品安全、环境监测等领域具有广泛应用前景。未来可进一步探索该ic-ELISA方法在其他小分子毒素、生物标志物等检测中的应用,并优化纳米酶的性能,以进一步提高检测的灵敏度和稳定性。同时,也可通过集成微流控技术,实现该检测方法的现场快速分析,为现实应用提供更多便利。

参考文献

Cho, C. H.; Kim, J. H.; Padalkar, N. S.; Reddy, Y. V. M.; Park, T. J.; Park, J.; Park, J. P., Nanozyme-assisted molecularly imprinted polymer-based indirect competitive ELISA for the detection of marine biotoxin. Biosens. Bioelectron. 2024, 255, 116269.