基于抗独特型纳米抗体和重组全长抗体的新型可持续免疫分析方法，用于灵敏检测阿特拉津

引言

免疫分析法作为重要的分析方法已被广泛应用于临床诊断、家用检测和低分子量化合物的安全性评估中。它们基于抗原和抗体之间的反应,具有多项优势,如灵敏度高、特异性强、操作简单、快速检测等。然而,抗原和抗体作为反应体系中的有限试剂,在工业生产中需要频繁更换,这对免疫分析技术的实际应用和标准化产品的可持续性提出了严格要求。需要对抗原和抗体的质量和稳定性进行严格控制。

单克隆抗体作为免疫分析的核心试剂,其持续生产通常依赖于杂交瘤细胞株的传代和体内诱导,这可能导致不同批次抗体的特异性和亲和力存在差异。此外,合成化学耦联的传统免疫分析用抗原也存在批次变异和不一致性,以及有机溶剂过多、成本高昂等问题。因此,开发环境友好、经济高效的免疫分析替代品,实现免疫分析技术的可持续性,已成为迫切需求。

近年来,能与另一抗体的抗原结合位点结合并阻碍抗原结合的抗-次类抗体开始应用于低分子量化合物免疫分析。与单链可变片段相比,纳米抗体具有更多优势,如稳定性强、可溶性高、热稳定性好和抗蛋白酶解等,是免疫试剂生产的理想替代品。

本研究以广泛使用的三嗪类除草剂阿特拉津(ATR)为目标,利用获得的ATR特异性重组全长抗体(ATR-rAb)和针对ATR的抗-次类纳米抗体(AI-Nbs),开发了一种新型可持续免疫分析法,以解决免疫分析批次变异和性能不一致的问题。该方法展示出良好的灵敏度和可靠性,为快速检测各种基质中的低分子量农药污染物提供了新的解决方案。

结果与讨论

1. 获得mAb 9F5的可变序列

为避免在杂交瘤细胞保存过程中易丢失阳性细胞的问题,应明确mAb 9F5的重链(VH)和轻链(VLκ)可变区域序列。通过Sanger测序确定了mAb 9F5的VH和VLκ基因序列,为后续表达重组全长抗体(ATR-rAb)奠定了基础。

2. 制备抗-次类纳米抗体(AI-Nbs)

采用交替使用一种共用蛋白(mAb 9F5)和两种非靶标mAb(mAb 9A10和mAb 12B6)的新方法进行亲和筛选,成功获得3种针对ATR的AI-Nbs(AI-Nb-7、AI-Nb-58和AI-Nb-66)。这与以往仅使用靶标mAb进行筛选的方法相比,可有效降低非特异性结合,提高AI-Nbs的特异性。

3. 表达ATR-rAb和AI-Nbs

利用包含VH和VLκ序列的质粒作为模板,通过同源重组在哺乳细胞HEK293(F)中表达并纯化了ATR-rAb。同样,将AI-Nbs基因克隆入表达载体并转染HEK293(F)细胞,也成功获得了6×His标记的AI-Nbs。

4. 基于AI-Nbs和ATR-rAb的可持续免疫分析

建立并评价了4种检测方法,包括基于ATR-OVA/ATR-rAb的间接竞争ELISA(icELISA)、基于AI-Nbs/ATR-rAb的icELISA(用于抗原替代品)、基于ATR-OVA/ATR-rAb的icELISA(用于标准替代品)以及基于ATR-rAb/AI-Nbs的直接竞争ELISA(dcELISA)。经优化,选择AI-Nb-66和ATR-rAb作为包被抗原和主要抗体建立了用于ATR残留检测的AI-Nbs/ATR-rAb基icELISA(用于抗原替代品)。该方法的半数抑制浓度(IC50)为1.66 ng mL^-1,线性范围为0.35-8.73 ng mL^-1。该方法对甲胺磷的交叉反应性为64.24%,对特丁津的交叉反应性为38.20%。

表面等离子共振(SPR)分析表明,这些具有交叉反应性的三嗪化合物在高浓度下可以在不同程度上结合到ATR-rAb;然而,结合/解离动力学曲线和相同浓度下的响应值不同,从而导致交叉反应性的差异。同源建模和分子对接揭示了三嗪环在识别三嗪化合物中的关键作用。该免疫分析在检测水果、蔬菜和黑茶中ATR的回收率为84.40-105.36%,表明其具有良好的检测性能。

5. ATR-rAb与三嗪化合物的特异性分子机制研究

基于SPR分析,确定了ATR-rAb的解离平衡常数。通过同源建模和分子对接方法,研究了ATR-rAb结合ATR的特异性分子机制。结果表明,三嗪环是ATR-rAb识别三嗪化合物的关键结构域。

结论

本研究开发了一种基于AI-Nbs和ATR-rAb的新型可持续免疫分析法,具有灵敏度高、可靠性强的特点,为快速检测各种基质中的低分子量农药污染物提供了新的解决方案。该方法有望成为未来农药残留检测的绿色、高效和可持续技术。未来可进一步优化分析方法,探索更多低分子量化合物的检测,推动免疫分析技术在食品安全和环境监测等领域的广泛应用。

参考文献

Zhao, J.; Li, P.; Abd El-Aty, A. M.; Xu, L.; Lei, X.; Gao, S.; Li, J.; Zhao, Y.; She, Y.; Jin, F.; Wang, J.; Hammock, B. D.; Jin, M., A novel sustainable immunoassay for sensitive detection of atrazine based on the anti-idiotypic nanobody and recombinant full-length antibody. Chem. Eng. J. 2024, 491, 152039.