基于CRISPR/Cas12a介导和DNA酶辅助级联双酶转化策略的电化学适体传感器用于玉米赤霉烯酮检测

引言

玉米赤霉烯酮(ZEN)是由赤霉菌产生的一种常见污染物,广泛存在于谷物、油脂等食品中。ZEN具有肝毒性、细胞毒性和免疫毒性,可导致肝癌、染色体异常和免疫功能障碍。更严重的是,它还具有很强的雌激素活性,可对人畜的生殖功能产生毒害。此外,ZEN具有高热稳定性,在储存和生产过程中毒性损失较小,这使得其污染范围进一步扩大。因此,开发高效灵敏的ZEN检测方法具有重要意义。

现有的检测方法包括高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)和气相色谱-质谱(GC-MS)等,这些方法准确可靠但设备昂贵,操作复杂,限制了其广泛应用。酶联免疫吸附试验(ELISA)作为另一种常用的ZEN检测方法,存在灵敏度不足和假阳性的问题。相比之下,电化学分析方法具有成本低、灵敏度高和响应快速的特点,因此备受关注。

基于电化学分析方法,生物分子识别事件可以转换为可测量的电信号,从而构建电化学生物传感器。其中,核酶脱氧核酶(DNAzyme)是一类在体外获得的具有高催化活性和识别能力的特殊核酸,具有制备简单、化学和热稳定性好、易修饰、非特异吸附低和相对经济等优势。Mg²⁺依赖性DNAzyme可特异地识别RNA并切割DNA底物,引发电极感应平台的循环反应,实现酶联级放大。同时,聚集规律间隔短回文重复序列及CRISPR相关蛋白(CRISPR/Cas)系统在生物传感和分子诊断领域备受关注,其中Cas12a具有高灵敏度、高特异性和快速识别能力,可以通过反式-切割活性对底物单链DNA进行大量切割。因此,将CRISPR/Cas12a系统与DNAzyme联用,以适配体调控反式-切割活性,构建级联双酶转换策略用于小分子ZEN的超灵敏检测,具有重要意义。

在痕量检测中,纳米材料由于其独特的结构和性质,有利于提高电化学生物传感器的灵敏度。氨基化二氧化锰(NH₂-MnO₂)具有良好的电化学性能和环境友好性,但电导率较差。将其与贵金属钯包裹金纳米棒(Pd@Au NBs)复合,可提高复合材料的导电性能。此外,磁性三氧化二铁(Fe₃O₄)与铂钯合金(PtPd)复合可作为信号标记材料,利用其大比表面积、优异的催化性能和介孔结构来提高检测信号。

本工作采用CRISPR/Cas12a系统和DNAzyme联级双酶转换策略,构建基于NH₂-MnO₂/Pd@Au NBs电极修饰和PtPd@Fe₃O₄-MB信号标记的电化学肽探针,实现对ZEN的超灵敏检测。在ZEN存在时,ZEN-适配体复合物可调控Cas12a的反式-切割活性,进而影响电极表面的Mg²⁺依赖性DNAzyme介导的催化切割过程,从而造成MB信号的变化,最终实现对ZEN的定量分析。此外,该电化学传感器还展示了良好的选择性、稳定性和重复性,并成功应用于玉米样品中ZEN的检测。

结果与讨论

1 NH₂-MnO₂/Pd@Au NBs的表征

首先采用透射电子显微镜(TEM)对制备的Au纳米棒(Au NRs)和钯包裹金纳米棒(Pd@Au NBs)进行表征。结果显示,Au NRs呈现典型的细长棒状结构,长度约50 nm。引入钯元素后,Pd@Au NBs呈现类似骨头的形貌,长度略大于Au NRs。元素分布分析表明,钯元素均匀分布在金纳米棒的表面,特别是两端。这说明钯成功包裹在金纳米棒表面,形成Pd@Au NBs核壳结构。

随后,采用扫描电子显微镜(SEM)观察氨基化二氧化锰纳米花(NH₂-MnO₂ NFs)及其与Pd@Au NBs复合物的形貌。MnO₂ NFs呈现典型的花状结构,直径约300 nm,具有大的比表面积。NH₂-MnO₂ NFs/Pd@Au NBs复合物中,MnO₂ NFs的表面褶皱减少,可能是由于Pd@Au NBs附着在表面所致。

2 CRISPR/Cas12a与DNAzyme联级双酶转换检测机理

该检测策略的工作原理如下:首先,将NH₂-MnO₂/Pd@Au NBs修饰在金电极(AuE)表面,以增加电极的导电性和电活性比表面积。然后将载有MB信号标记的PtPd@Fe₃O₄探针固定在修饰电极上,获得初始MB氧化信号。在ZEN不存在时,适配体可自由与CRISPR/Cas12a系统的crRNA杂交,激活Cas12a的反式-切割活性,导致溶液中DNAzyme探针被切割。当电极表面加入反应液时,Mg²⁺依赖性DNAzyme无法与信号标记探针杂交,从而无法引发MB信号的减少。相反,当引入ZEN时,适配体与ZEN结合,降低有效激活的Cas12a,溶液中大部分Mg²⁺依赖性DNAzyme未被切割。因此,反应液加到电极表面时,Mg²⁺依赖性DNAzyme可与信号标记探针杂交,在Mg²⁺的诱导下发生催化切割反应,导致MB信号的减少。通过CRISPR/Cas12a系统调控Mg²⁺依赖性DNAzyme的活性,实现了对ZEN的超灵敏检测。相比于传统方法,该策略具有检测灵敏度高、选择性好、稳定性佳等优点。

3 电化学性能表征

为了评价电极修饰材料和信号标记材料的性能,采用循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱(EIS)对电极的电化学行为进行了表征。结果显示,与裸金电极相比,NH₂-MnO₂/Pd@Au NBs修饰电极具有更大的电流响应和更低的电荷转移电阻,表明其具有优异的导电性能和电催化活性。此外,PtPd@Fe₃O₄-MB作为信号标记材料,可在电极表面提供稳定的初始MB氧化信号。与Fe₃O₄-MB相比,PtPd@Fe₃O₄-MB的氧化电流强度更大,表明引入PtPd合金可有效提高MB的电化学响应。

4 检测性能评估

考察了所构建电化学肽探针对ZEN的检测性能。在最优条件下,该传感器表现出1×10^-5到10 ng•mL^-1的宽线性范围,检测限可达6.27×10^-6 ng•mL^-1,远优于现有的电化学传感器。同时,该传感器对ZEN具有良好的选择性,可有效区分ZEN与其他常见毒素,并在实际玉米样品中实现了ZEN的准确定量检测。此外,该传感器在连续使用10次和储存30天后,仍保持良好的重复性和稳定性,表明其具有广泛的应用前景。

结论

本工作成功构建了基于CRISPR/Cas12a和DNAzyme联级双酶转换策略的电化学肽探针,用于ZEN的超灵敏检测。NH₂-MnO₂/Pd@Au NBs复合材料作为电极修饰材料,提高了电极的导电性和电催化性能。PtPd@Fe₃O₄-MB作为信号标记材料,可在电极表面提供稳定的初始MB氧化信号。CRISPR/Cas12a系统的反式-切割活性受适配体调控,进而影响Mg²⁺依赖性DNAzyme的催化切割过程,实现了对ZEN的高灵敏、高选择性检测。该传感器在检测灵敏度、稳定性和重复性等方面均表现优异,为ZEN等小分子污染物的快速准确检测提供了新思路。

参考文献

Yan, H.; He, B.; Zhao, R.; Ren, W.; Suo, Z.; Xu, Y.; Xie, D.; Zhao, W.; Wei, M.; Jin, H., Electrochemical aptasensor based on CRISPR/Cas12a-mediated and DNAzyme-assisted cascade dual-enzyme transformation strategy for zearalenone detection. Chem. Eng. J. 2024, 493, 152431.