轻松制备具有过氧化物酶样活性的三原子 Fe/Zn/Ir 发光纳米酶，用于双模褪黑激素检测

引言

天然酶由于其优异的催化活性和高选择性在温和条件下工作,可以产生高度放大的信号从而实现高灵敏度的检测分析。但天然酶应用受限于其自身的缺点,如稳定性差、保存条件苛刻、价格昂贵等。因此,科研人员一直致力于探索天然酶的替代品-纳米酶。纳米酶具有各种酶活性,如超氧化物歧化酶(SOD)样活性、过氧化物酶(POD)样活性、氧化酶(OXD)样活性和过氧化氢酶(CAT)样活性,其催化活性可由pH、光照、离子、温度、磁场等因素调控。凭借高稳定性、可调活性和良好的生物相容性,纳米酶已成为监测抗氧化剂、毒素分子、抗生素和癌症生物标志物的有力探针。

褪黑素(MT)是一种重要的生理调节剂,在体内的正常浓度范围为10-200 pg·mL^-1。MT浓度降低可能会导致某些癌症的发生,因此建立准确检测MT的方法具有重要意义。已有多种检测MT的技术被开发,包括高效液相色谱法(HPLC)、放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、电化学检测法、荧光法和比色法等。其中,基于POD样纳米酶的比色法和发光法由于反应条件温和、分析过程简单、操作方便等优势受到广泛关注。然而,现有的模拟酶通常存在催化活性低、活性位点不确定、选择性差等问题,严重限制了它们在MT检测中的应用。因此,开发具有优异活性、高选择性和明确活性位点的纳米酶来构建灵敏的MT检测平台非常必要。

单原子纳米酶(SAzymes)由于具有最大限度利用原子、原子分散的金属活性位点以及独特的电子结构和几何结构等优点,最近引起了广泛关注。SAzymes通常具有高稳定性、大规模生产和低成本等优势,成为替代天然酶的有力候选。作为一类金属有机框架(MOFs)的沸石-咪唑盐框架(ZIFs)由含有丰富N原子的咪唑配体组成,能够用于负载单原子金属如Fe、Co、Ir、Mn等。此外,多金属活性中心的协同催化作用也受到广泛关注,已有多种双原子和三原子纳米酶被报道具有优异的POD样活性。

作为一种新兴的催化材料,铱(Ir)基纳米材料由于具有高催化活性和出色的稳定性而备受关注。有趣的是,Ir原子可以与MOF的有机连接体配位,前人报道了Ir原子可以锚定在UiO-66、[Ir(C₂H₄)₂Cl]₂可以结合到多孔MOF以及溶剂-配体Ir(III)配合物可以与咪唑基团配位等。作为一种包含大量咪唑基团的ZIF-8,为Ir(III)配合物的共价修饰提供了理想的平台。

本文通过将Ir(III)配合物共价固定到双金属有机框架Fe/ZIF-8上制备了一种三原子金属位点纳米酶(TAzyme) - Fe/Zn/Ir。该TAzyme不仅具有优异的POD样活性,还表现出独特的发光性质。利用此特性实现了对MT的双模式灵敏检测。此外,我们还将Fe/Zn/Ir制备成检测棒,实现MT的便携式裸眼检测。该多功能TAzyme为开发新型高效纳米酶提供了新思路。

结果与讨论

1. Fe/Zn/Ir纳米酶的结构表征

扫描电镜和透射电镜表明,Fe/Zn/Ir保持了ZIF-8的多面体结构,并且纳米粒子独立分散。动态光散射测试显示Fe/Zn/Ir的平均粒径约为300 nm。高分辨透射电镜进一步证实Fe/Zn/Ir中不存在任何金属团簇。X射线衍射结果与ZIF-8的特征衍射峰吻合,表明引入Ir(III)配合物并没有破坏ZIF-8的晶体结构。能量色散X射线谱映射图显示C、N、Zn、Fe、Ir、O和P元素在Fe/Zn/Ir中分布均匀,证实了Ir(III)配合物、Fe/ZIF-8和PZM膜成功组装。

高角环形暗场扫描透射电镜清晰显示Fe/Zn/Ir中存在大量孤立的Fe、Ir和Zn原子位点,没有出现金属簇。X射线光电子能谱结果进一步证实了Fe/Zn/Ir的元素组成。Fe 2p谱图中的特征峰对应Fe³⁺,Zn 2p谱图表明存在Zn²⁺,Ir 4f谱图中Ir 4f7/2和Ir 4f5/2峰相比Ir(III)配合物均有0.47 eV的负移,说明Ir(III)配合物已与ZIF-8上的咪唑基团配位。此外,傅里叶变换红外光谱也验证了Ir(III)配合物成功偶联到Fe/ZIF-8上,并且PZM膜均匀修饰在Fe/Zn/Ir纳米复合物表面。综上所述,Fe/Zn/Ir由Fe/ZIF-8、Ir(III)配合物和PZM膜组成,其中Ir(III)配合物通过与ZIF-8的咪唑基团配位而稳定地偶联在Fe/ZIF-8上,PZM膜进一步修饰在复合物表面。

2. Fe/Zn/Ir纳米酶的过氧化物酶样活性

评价Fe/Zn/Ir的POD样活性时,以TMB为色源底物、H₂O₂为氧化剂,Fe/Zn/Ir可催化TMB被氧化生成蓝色的氧化型TMB,在652 nm处有特征吸收峰。实验结果表明,Fe/Zn/Ir具有优异的POD样活性,其催化效率高于其他常见的显色底物OPD和ABTS。此外,通过动力学测试发现,Fe/Zn/Ir对TMB和H₂O₂的亲和力(K_m值)分别为0.37 mM和0.12 mM,最大反应速度(V_max)为408.2 μM·min^-1·mg^-1和427.2 μM·min^-1·mg^-1。这些结果表明,Fe/Zn/Ir纳米酶具有优异的POD样催化性能,为后续MT的高灵敏检测奠定了基础。

3. 双模式MT检测平台的构建与应用

利用Fe/Zn/Ir纳米酶的POD样活性和独特的发光性质,我们成功构建了对MT进行双模式检测的平台。在MT浓度升高的情况下,检测体系的吸光度下降而发射强度却增强。这是由于MT会抑制Fe/Zn/Ir对TMB的氧化,从而减少生成的oxTMB,导致吸光度降低;但与此同时,Fe/Zn/Ir的发光被oxTMB猝灭的程度也随MT浓度的增加而降低,因此发射强度升高。基于此,该平台实现了MT的双模式检测,分别测得检测限(LOD)为8.9 nM (比色法)和8.8 nM (发光法),两种检测结果相互印证。

此外,将Fe/Zn/Ir制备成检测棒,用于实现MT的便携式裸眼检测。随MT浓度升高,检测棒由无色变为深蓝色,且颜色变化程度与MT浓度呈良好的线性关系。检测棒能够在15 min内检测出50 μM以下MT的存在,为MT的快速现场检测提供了新方案。该多功能TAzyme具有优异的POD样活性和独特的发光性质,为MT检测提供了新思路,也为探索新型高效纳米酶开发提供了新概念。

总结与展望

本文通过将Ir(III)配合物共价结合到双金属ZIF-8框架上制备了一种三原子金属位点纳米酶Fe/Zn/Ir。该TAzyme不仅具有优异的过氧化物酶样活性,而且表现出独特的发光性质。利用这些特性,我们成功构建了对MT进行双模式(比色和发光)检测的灵敏平台,检测限达8.9 nM和8.8 nM。此外,我们还将Fe/Zn/Ir制备成检测棒用于MT的便携式裸眼检测。该多功能TAzyme为生物传感领域的新型高效纳米酶开发提供了新思路。未来,我们可以进一步探索其他金属元素组合,优化纳米酶的性能,拓展至更多生物大分子和环境污染物的检测应用。

参考文献

Yin, L.; Xing, B.; Liu, Z.; Lu, L., Facilely fabricating triple-atom Fe/Zn/Ir luminescent nanozymes with peroxidase-like activity for dual mode melatonin detection. Chem. Eng. J. 2024, 493, 152663.