免疫色谱分析集成基于智能手机的设备，使用核壳上转换纳米颗粒同时检测多种霉菌毒素

真菌毒素是由丝状真菌产生的有毒次生代谢物，广泛存在于粮食作物和饲料中，对食品安全构成严重威胁。为控制霉菌毒素污染，中国对谷物中DON、AFB1和ZEN的最高含量设定了标准。研究表明，多种真菌毒素常常同时存在于食品中，导致其联合毒性可能增加健康风险。因此，迫切需要开发灵敏、特异且能同时检测多种真菌毒素的快速分析方法。近年来，免疫层析法因其高特异性、操作简便和快速反应等优点，已广泛应用于食品真菌毒素的检测。然而，传统胶体金标记物灵敏度较低，无法满足定量检测需求。新型纳米材料，如上转换纳米颗粒（UCNPs），因其优越的发光特性而被引入检测领域，为多种真菌毒素的快速筛选提供了新的可能性。随着智能手机技术的发展，将其与新型检测方法结合，有望实现实时定量监测。

基于此，德克萨斯大学奥斯汀分校研究者开发了一种新型的核壳上转换纳米颗粒（UCNPs）免疫层析法（UCNPs-mICA），能够同时检测谷物中的脱氧雪腐菌醇（DON）、黄曲霉毒素B1（AFB1）和玉米霉烯酮（ZEN）。该方法采用合成均匀尺寸、优良荧光性能的核壳UCNPs（NaYF4: Yb, Er@NaYF4: 10%Yb）作为信号标记物。UCNPs-mICA的组成包括PVC底板、样品垫、偶联垫、硝化棉膜（NC膜）和吸收垫（如图1所示）。NC膜上分别喷涂了DON-BSA、AFB1-BSA和ZEN-BSA等抗原，并用山羊抗小鼠IgG进行标记。通过将UCNPs-mICA与自主开发的智能系统结合，研究者实现了通过智能手机获取定量结果，显著提高了检测效率。

图1 摘要图。

采用改进的水热法合成了具有优异发光性能和稳定性的核壳UCNPs，作为新型ICA信号标记物。设计的免疫层析试纸条允许样品中的真菌毒素与T线上的抗原竞争，从而与荧光探针上的抗体结合。

如果分析物存在，三种真菌毒素会与相应的抗体结合，导致T线信号强度减弱；若不存在，则抗体与抗原结合，T线发出强烈荧光信号。荧光强度与目标真菌毒素浓度成反比，而C线始终发出荧光。为定量检测，试纸快速插入荧光扫描仪并使用智能系统进行测量，通过标准曲线计算样品中霉菌毒素浓度，以判断是否超过国家标准限量。

实验中制备了包被活性壳层的UCNPs，并通过透射电镜（TEM）表征其纳米颗粒大小和形貌。结果显示，所制备的UCNPs尺寸均匀、形状规则，并具有良好的结晶性。研究还表明，核壳结构显著提高了发光强度和效率，同时有效减少了表面猝灭效应，CS-10Yb被认为是最佳的荧光探针材料。此外，通过FT-IR和UV-vis光谱验证了UCNPs的表面改性和良好水溶性，为后续霉菌毒素检测奠定了基础。

图2. 合成核-壳UCNPs的表征。核壳上不同Yb3+浓度的UCNPs的TEM图像(A-E)、直径分布图(F-J)、XRD光谱(K)、上转换发射光谱(L)和UV-vis光谱(M)。图(L)中的插图显示了相应的积分强度(左)和环己烷溶液(右)中的荧光示意图。

在最优检测条件下，研究评估了核壳上转换纳米颗粒（UCNPs）免疫层析法（mICA）条带中真菌毒素浓度与荧光强度的关系，以及脱氧雪腐菌醇（DON）、黄曲霉毒素B1（AFB1）和玉米霉烯酮（ZEN）的最低检出限（LODs）。结果显示，随着DON、AFB1和ZEN浓度的增加，相应T线的荧光强度不断下降，符合竞争检测原理。DON、AFB1和ZEN的截止值分别为1.08、0.78和0.97。在浓度范围内，DON、AFB1和ZEN分别为0.25 ng/mL至1000 ng/mL、0.05 ng/mL至50 ng/mL和0.1 ng/mL至100 ng/mL，均呈现良好的线性关系。最终，计算得出DON、AFB1和ZEN的LODs分别为0.25 ng/mL、0.05 ng/mL和0.1 ng/mL。与传统的三种真菌毒素单检测CG-ICA相比，开发的核-壳UCNPs-mICA条带的灵敏度提高了至少20倍。

图3. 核-壳UCNPs-mICA条带检测DON (A)、AFB1 (B)和ZEN (C)标准的灵敏度和线性拟合标准曲线(D)。

真菌毒素的水溶性差异显著，AFB1和ZEN几乎不溶于水，而DON相对易溶。为有效提取这些毒素，通常使用甲醇、乙腈或乙醇等有机试剂。研究表明，五种预处理提取液对玉米和小麦样品中三种霉菌毒素的回收率影响显著。水对DON的提取效果较好，但对AFB1和ZEN效果较差。甲醇-乙腈-水、甲醇-水和乙腈-水的回收率均高于乙醇-水，且甲醇-乙腈-水的回收率最高，介于98%至104%之间。

此外，采用核壳UCNPs-mICA检测玉米和小麦中的DON、AFB1和ZEN，得出其最低检出限（LODs）分别为0.25 μg/kg、0.1 μg/kg和0.25 μg/kg。尽管实际样品测试中灵敏度略有下降，但该方法有效抵抗基质干扰。回收率显示，DON在玉米和小麦中的回收率分别为90.66%至105.73%和85.25%至101.01%。AFB1和ZEN的回收率也在可接受范围内，表明该方法在复杂食品基质中同时检测霉菌毒素的有效性。

图5. 核-壳UCNPs-mICA条带检测玉米(A-D)和小麦(E-H)中DON、AFB1和ZEN的灵敏度及线性拟合标准曲线

本实验开发了一个用户友好的智能应用系统，旨在利用核壳上转换纳米颗粒（UCNPs）免疫层析法（mICA）快速定性或定量检测各种真菌毒素。系统包括web界面和移动界面，用户可以方便地在不同目录中切换单一或多种霉菌毒素的检测。移动界面提供个人中心、目录管理、图像显示、标准曲线拟合、实际样品检测及数据导出等功能。该智能系统用于测定经高效液相色谱法确认的天然谷物样品中的霉菌毒素污染水平。结果显示，实际样品中DON、AFB1和ZEN均有不同程度的同时污染，且核壳UCNPs-mICA方法能够检测到HPLC法无法识别的微量污染。检测结果与HPLC法基本一致，表明该智能系统的准确性和可靠性。此外，该系统在玉米和小麦中对DON、AFB1和ZEN的回收率良好，且具有较低的变异系数（CVs），证明其稳定性。综上所述，该智能系统为谷物中多种真菌毒素的现场监测提供了一种便携、快速且敏感的工具，从而降低了人工和材料成本

图6所示。智能系统运行流程示意图

本研究成功开发了一种结合智能手机设备的免疫层析分析方法，用于同时检测谷物中DON, AFB1和ZEN的核壳上转换纳米颗粒。核-壳UCNPs-mICA检测方法具有灵敏度高、特异度高、可用性好、可靠性好、时效性高等优点。在玉米和小麦中，DON、AFB1和ZEN的lod分别为0.25 μg/kg、0.1 μg/kg和0.25 ~ 0.5 μg/kg，具有较强的抗干扰能力。此外，结合智能手机系统，结果与验证型高效液相色谱法的结果吻合良好。该方法不仅可用于真菌毒素污染的早期痕量检测，还可用于谷物中多种真菌毒素污染的现场监测。在未来，新方法还需要探索一些挑战，如建立核-壳UCNPs的标准制备方法，扩大对食品类别(如花生)的评价，从而提高食品中多种真菌毒素快速检测的商业应用前景。

论文链接：Yanghong Shen, Yiyi Chen, Haifeng Wang, Xiuling Zhao, Haixia Lu, Junli Zhu. Immunochromatographic assay integrated smartphone-based device for simultaneous detection of multiple mycotoxins using core-shell up-conversion nanoparticles. Sensors & Actuators: B. Chemical, 2024, 398 : 134783.