单细胞蛋白质组学分析突破：定量哺乳动物细胞中多达3000种蛋白质

“鸟枪法”蛋白质组学分析是目前最有潜力的单细胞蛋白测序技术，但其对每个细胞~1000个蛋白的鉴定水平仍不足以进行实际应用。近期，浙江大学化学系方群教授团队在国际权威期刊《Nature Communications》上发表了题为“Pick-up single-cell proteomic analysis for quantifying up to 3000 proteins in a Mammalian cell”的研究成果，研究团队开发了一个提取单细胞蛋白质组学分析（PiSPA）工作流程，以实现一个深度识别，能够使用无标记定量方法定量哺乳动物细胞中多达3000个蛋白质组。PiSPA工作流程是专门基于纳米级微流控液体处理机器人，能够在拾取操作策略下实现单细胞捕获、预处理和注入。利用这种定制的工作流程，分别对单个A549细胞（n = 37）、HeLa细胞（n = 44）和U2OS细胞（n = 27）的2449-3500、2278-3257和1621-2904蛋白组进行定量。得益于灵活的细胞提取能力，团队在单细胞蛋白质组水平上研究了HeLa细胞的迁移，展示了从单细胞视角在实际生物学研究中的潜力。

关键发现

1、PiSPA工作流程的建立

图1 用于单细胞蛋白质组学分析的PiSPA工作流程示意图

图2 系统的优化和性能

研究团队首先将改进的微流体液体处理机器人37，之前基于顺序操作液滴阵列（SODA）技术38,39集成到PiSPA平台中，以实现纳米级的单细胞分选和在探头拾取模式下多步预处理。单细胞蛋白质组学分析的总工作流程解决方案（见图1），能够在单个哺乳动物细胞中实现多达3000个蛋白质组的深度鉴定。在蛋白质消化实验中，研究团队以单个HeLa细胞为样本，研究了酶/蛋白比值对蛋白质鉴定数的影响。在常规的蛋白质组学实验中，通常采用1：100~1：10之间的酶/蛋白比值作为优化的消化条件。目前的单细胞蛋白质组学工作流程也遵循酶/蛋白比范围13、16、18、19、30、31。然而，研究团队的实验结果（图2a）显示，单细胞蛋白鉴定数随着酶/蛋白比值的增加而呈增加的趋势。LC分离中梯度程序的选择对色谱分离性能和蛋白质组鉴定结果有重要影响。研究团队使用14、18、21、28、48、48和68 min的梯度，以200 pg标准HeLa细胞消化为样本，评估了不同梯度时间对单细胞蛋白质组学分析的影响（图2b）。在DIA和DDA模式下，平均有1469和618个蛋白组（图2c）的数量变异系数分别为4.7%和2.3%。成对相关分析（Python包熊猫，版本1.4.4）10QC样本之间的蛋白质量化数据显示，所有的皮尔逊相关系数超过0.99（直径模式）和0.85（DDA模式）（图2d），展示良好的稳定性（尤其是直径模式）的系统在蛋白质组学分析水平。

2、哺乳动物细胞的单细胞蛋白质组学分析

图3 PiSPA平台在单个哺乳动物细胞蛋白质组学分析中的应用

利用目前的工作流程和平台，研究团队对A549、HeLa和U2OS细胞进行了单细胞蛋白质组学分析，采用DIA和DDA模式，最佳酶/蛋白比为50：1，梯度时间为21 min。在DIA模式下，单个A549细胞（=37）、HeLa细胞（=44）和U2OS细胞（=27）中平均分别定量2467（1804-3349）、2421（1778-3049）和1705（1074-2487）蛋白组（图3a）。这些结果表明，PiSPA平台对单个细胞的定量鉴定结果具有较高的重现性。在上述单细胞蛋白质组学实验中，分别捕获143和172个单细胞进行DIA和DDA模式进行分析，最终获得108和148个有效单细胞数据，平均单细胞捕获/分析效率分别为76%和86%。

3、LC-MS系统的定量精度和精度的评价

图4 LC-MS系统的定量精度和精度的评价

为了评估目前的LC/MS系统的定量准确性和精密度，研究团队比较了0.2 ng、0.4 ng、0.6 ng、0.8 ng和1 ng HeLa酶切物（n = 6）的定量结果。使用0.2 ng HeLa消化作为参考计算蛋白质丰度折叠变化（FC）值为每个量化蛋白质，比例线性增加蛋白质折叠变化的蛋白质数量的增加HeLa消化可以观察到R20.9995（图4）。随着蛋白质量的增加，定量精度从200 pg HeLa消化的变异系数（CV）的25.6%提高到1ng HeLa消化的14.9%（图4b）。这些结果表明，本LC-MS系统在单细胞和少量细胞水平上具有良好的定量准确性和精度。

4、迁移细胞的单细胞蛋白质组学分析

图5 利用PiSPA平台在划痕实验中应用于单个迁移细胞的蛋白质组学分析

细胞迁移是一个常见的生物学过程，对肿瘤迁移、伤口愈合、胚胎发育、免疫反应等方面的研究具有重要意义。目前，划痕法常用于检测贴壁肿瘤细胞的侵袭转移能力，而目前还没有关于在深覆盖蛋白质组水平上对具有不同迁移行为的单个肿瘤细胞的研究报道。PiSPA平台能够观察单个迁移细胞的行为，可靠地提取目标细胞，并在单细胞水平上对这些细胞进行深度覆盖的蛋白质组学分析，以突出具有不同表观迁移特性的细胞之间的单个蛋白差异。

研究团队使用HeLa细胞进行划痕实验，捕获了46个具有显著迁移行为的单细胞（图5a）和43个没有明显迁移行为的单细胞（对照）细胞，并使用PiSPA平台进行分析。在DIA（MBR）模式下，分别从单个迁移细胞（= 46）和对照细胞（= 43）中平均定量2544个（2058-3308）和2893个（1896-3710）蛋白组。其中，超过78%的蛋白质被两个或两个以上的特征肽进行定量。经过批量校正和归一化后，通过UMAP将数据聚类为三个不同的聚类（图5b）。簇1（n = 42）主要由迁移细胞组成（n = 35,83%），而簇2（n = 31）和簇3（n = 16）主要由对照细胞组成（n = 26和n = 10，分别为83%和63%）。通过单独比较三个聚类，筛选出226个显著不同的蛋白。采用层次聚类分析（HCA）定量评估三个聚类之间的蛋白质组成的差异（图5c），以确定不同聚类之间的异质性。目前应用单细胞蛋白质组学在细胞迁移实验只是一个初步的原理证明，而它可以证明PiSPA平台有潜力揭示背后的内在控制因素明显的行为，以前很难检测使用传统的组学方法对大量的细胞样本，并可以提供一个有效的工具为细胞迁移研究以及抗癌方法和药物的发展。

结论

在本工作中，研究团队在单细胞蛋白质组学分析的平台构建、方法开发和性能改进的整个过程中都采用了单细胞定制策略，包括单细胞分选、样品预处理、色谱注射和分离、质谱检测和数据处理的工作流程。为了实现蛋白质鉴定深度和单细胞分析可靠方便的操作，开发了一种全解决方案。PiSPA平台使用拾取模式实现了单细胞分选，这不同于流式细胞术、CellenONE或基于单细胞稀释的限制性分选方法。

原文：Wang, Y., Guan, Z. Y., Shi, S. W., Jiang, Y. R., Zhang, J., Yang, Y., Wu, Q., Wu, J., Chen, J. B., Ying, W. X., Xu, Q. Q., Fan, Q. X., Wang, H. F., Zhou, L., Wang, L., Fang, J., Pan, J. Z., & Fang, Q. (2024). Pick-up single-cell proteomic analysis for quantifying up to 3000 proteins in a Mammalian cell. Nature communications, 15(1), 1279. https://doi.org/10.1038/s41467-024-45659-4.