葡萄糖和氨基酸的综合稳定同位素示踪确定CHO细胞培养中的代谢副产物及其来源

哺乳动物的细胞培养过程被广泛用于生物治疗药物的生产、疾病诊断和生物传感器，因此，应该进行优化，以支持强大的细胞生长和生存能力。然而，由于代谢活动和营养利用的低效率，有毒的副产品在培养物中积累。在本研究中，研究团队对2株免疫球蛋白G（IgG）进行了¹³C稳定同位素追踪，以确定其分泌的副产物并追踪其来源。CHO细胞在缺失单一氨基酸或葡萄糖的培养基配方中培养，该配方中添加了缺失底物的¹³C示踪剂，然后进行气相色谱-质谱（GC-MS）分析，以跟踪标记的碳流动和识别副产品。研究团队追踪了所有分泌的副产物的来源，并验证了45种副产物的身份，其中大部分来自葡萄糖、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸。除了之前鉴定的副产物外，研究团队还鉴定了几种代谢物，包括2-羟基异戊酸、2-氨基丁酸、L-异源异亮氨酸、酮异亮氨酸、2-羟基-3-甲基戊酸、去苯氨酸醇和2-氨基丁酸。当添加到不同浓度的CHO细胞培养物中时，某些代谢物抑制了细胞生长，而其他代谢物包括2-羟基酸，令人惊讶地减少了乳酸积累。体外酶学分析表明，2-羟基酸被乳酸脱氢酶代谢，提示可能存在降低乳酸积累的机制，如竞争性底物抑制。开发的¹³C标记辅助代谢组学管道和确定的代谢物将作为一个跳板，通过改变培养基配方和途径工程策略，减少不良的副产品积累，并减轻用于生物制造和其他应用的哺乳动物培养物中的低效底物利用。

关键发现：

1、 总体稳定同位素示踪可以识别来自葡萄糖和氨基酸的代谢副产物

图1 综合稳定同位素示踪可以识别来自葡萄糖和氨基酸的代谢副产物

为了更好地了解培养中的哺乳动物细胞分泌的小分子及其来源，研究团队使用两种哺乳动物细胞系CHO-K1和GS-CHO进行了全范围的碳同位素追踪研究，每种细胞系都产生重组IgG。使用化学定义的培养基，CHO细胞分别在21个和20个单独的分批培养中生长，其中一个特定底物完全¹³C标记，葡萄糖或特定氨基酸（图1A）。由于GS-CHO细胞具有异源谷氨酰胺合成酶（GS）基因，因此没有使用该异源谷氨酰胺示踪剂。在第0天和第5天收集废培养基样品，经化学处理的MOX (2%甲氧基胺·吡酸）-TBDMS（叔丁基二甲基硅氯）衍生物，并进行气相色谱-质谱分析。在乏介质的总离子色谱中，共鉴定出214个峰，91个峰强度增加，91个峰强度减少，32个峰强度没有变化（第0~第5天的变化小于20%）（图1A）。

2、 由葡萄糖衍生的代谢副产物通过核心代谢途径产生

图2 分泌代谢物的鉴定和验证

为了确定每个峰对应的化合物的身份，研究团队利用了（MOX-）TBDMS衍生物在GC-MS分析中产生特征片段的事实（图2A）。具体来说，在（MOX-）TBDMS衍生物的质谱中最丰富的离子之一是M-57离子（由于TBDMS侧基中C4H9的损失），其中M是衍生分子的分子量。衍生化第一步的MOX处理保护酮基（图2A）；没有这一步骤，含有酮基的化合物很难通过质谱检测。如图2B所示，根据它们的分子大小和质量同位素分布，为许多峰分配假定的代谢物。然后，研究团队用纯分析标准验证了其中45个代谢副产物的鉴定。大量含有葡萄糖¹³C标记的代谢副产物来自核心代谢途径，如糖酵解和三羧酸循环（图2C）。

3、 由氨基酸产生的代谢副产物是由酶的混杂活性引起的

图3 氨基酸的代谢副产物是酶的混杂活性

总的来说，本研究中确定的大部分代谢副产物都来自于氨基酸的代谢，即91个峰中有50个峰的强度不断增加。这包括先前报道的副产品，如2-甲基丁酸、异戊酸、同型半胱氨酸、2-羟基丁酸、苯乳酸、内乳酸、对羟基苯乳酸、酮缬氨酸、酮油氨酸、o-酪氨酸、2-羟基异丙酸和苯乙酸。此外，研究团队鉴定了一些来自CHO细胞的氨基酸代谢物，包括2-羟基异缬氨酸（来自缬氨酸）；L-异亮氨酸、酮异亮氨酸和2-羟基-3-甲基戊酸（来自异亮氨酸）；间苯二酚和2-氨基丁酸（来自蛋氨酸）；瓜氨酸/鸟氨酸（来自精氨酸）（图3A)。这些代谢物大多数在哺乳动物细胞中氨基酸分解的典型途径中没有发现（图3B中的绿色箭头）。为了解释这些代谢物的存在，研究团队假设了替代的非典型代谢反应（图3B中的红色箭头）。代谢产物异戊酸、2-甲基丁酸和异丁酸（分别来自亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）可能由异戊基辅酶a、2-甲基丁基辅酶A和异丁基辅酶A产生，这些都是支链氨基酸典型分解途径的中间产物（图3B）。总的来说，研究结果表明，CHO细胞在分批培养中分泌一组类似的代谢副产物。

4、 CHO细胞对分泌的副产物的敏感性依赖于细胞系

图4 CHO细胞对分泌的副产物的敏感性及其对乳酸生成的影响

先前的研究表明，氨基酸部分分解产生的代谢副产物会对CHO细胞培养产生负面影响。为了评估这些化合物的潜在毒性，研究团队评估了20种已鉴定的代谢副产物对CHO细胞性能的影响，包括8种2-羟基酸、3种2-酮酸、4种非蛋白原性氨基酸和5种有机酸（图4A）。同型半胱氨酸在2 mM时对GS-CHO细胞具有毒性（图4A），但对CHO-K1细胞的生长没有影响（即使在5 mM时，图4A），这表明CHO-K1细胞可能循环、再利用或将同型半胱氨酸重定向到其他途径。相比之下，几种2-羟基酸在5 mM时对CHO-K1细胞有毒性，但对GS-CHO细胞的生长影响很小或没有影响（图4A），这表明GS-CHO细胞可能重新利用或耐受2-羟基酸。研究团队观察到，当加入高浓度（2和5 mM）的培养物时，许多代谢副产物的产物滴度降低了约10-20%（图4A）。然而，当以低水平（0.5 mM）添加时，除同型半胱氨酸、茚乳酸和苯乳酸外，产物效度没有显著影响（图4A）。

5、 2-羟基酸减少了CHO细胞培养物中乳酸的产生，并且很可能是由LDH产生的

图5 代谢副产品的补充会影响其他副产品的分泌

图6 LDH是一种混杂的酶，它可以将广泛的2-羟基酸转化为它们各自的2-酮酸

虽然没有一种代谢物能提高CHO的生长速率，但有一些代谢物显著降低了乳酸的积累（图4）。特别是，多种2-羟基酸使乳酸的产量降低了高达60%，例如，在5 mM时，2-羟基异戊酸，而没有显著影响细胞生长（图4B）。在向细胞培养中添加2-羟基酸的实验中，研究团队没有只观察到乳酸产量减少，但也减少了其他2-羟基酸的积累（图5）。此外，补充2-羟基酸会导致下游代谢副产物的水平显著升高，这将需要将2-羟基酸转化为2-酮酸。例如，补充2mM2-羟基-3-甲基戊酸使2-甲基丁酸水平增加了两倍，补充2 mM苯乳酸使苯乙酸水平增加了15倍，补充5mM2-羟基异丙酸使异戊酸水平增加了两倍，补充5mM2-羟基丁酸使2-氨基丁酸水平增加了12倍（图5）。研究团队发现，LDH不仅将乳酸转化为丙酮酸、天然的2-羟基酸和2-酮酸底物/产物，而且还将其他8种2-羟基酸以较高的速率转化为各自的2-酮酸（图6）。虽然这些结果并不排除其他脱氢酶可能也会参与CHO细胞培养中2-羟基酸的产生，但它确实表明，鉴于LDH在CHO细胞中的高表达，它可能是参与这些转化的主要酶。

结论

在本研究中，开发并应用了一种广泛适用的稳定同位素营养标记策略，以及基于GC-MS的分析和代谢组学流程，以识别和跟踪氨基酸和葡萄糖产生的分泌代谢物，可应用于各种哺乳动物细胞系统。利用这种方法，研究团队在两种广泛使用的CHO细胞培养系统的细胞培养中鉴定并验证了45种葡萄糖和氨基酸分解代谢中分泌的代谢积累的代谢副产物，包括大量以前未报道的代谢物。对于分泌的副产品，研究团队确定了营养来源，并提出了可能参与其生产的酶。大多数已鉴定的代谢物来自于葡萄糖、BCAAs、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的分解代谢。一些已鉴定的代谢物，当补充到不同浓度的CHO细胞培养物时，抑制了细胞生长，而其他的，特别是2-羟基酸，如2-羟基异戊酸，减少了乳酸积累。体外酶学分析表明，所有鉴定出的2-羟基酸都是LDH的底物，这表明了在培养物中观察到的乳酸积累降低的可能机制。此外，补充一些分泌的副产物会导致其他产品的分泌增加。这些产品的分泌增加可能是由于通过直接代谢联系消耗代谢物，例如，补充酮异亮氨酸后2-甲基丁酸产量增加，l-异亮氨酸和2-羟基-3-甲基戊酸产量增加，补充苯乳酸增加苯乙酸产量，增加补充2-氨基丁酸增加2-羟基丁酸产量。然而，其他产物的分泌可能是由于间接代谢联系引起的，例如，补充酮亮氨酸后酮异亮氨酸、L-异亮氨酸、酮缬氨酸、2-羟基丁酸和去苯甲酚醇的产量增加（图5），苹果酸、富马酸、琥珀酸、甘油、邻酪氨酸、酮缬氨酸、瓜氨酸/鸟氨酸和红氨酸的产量增加（图5）。有可能是供应的代谢物触发了细胞反应，即细胞对细胞外环境的变化或波动作出反应，并最终激活负责产生不参与供应代谢物直接代谢途径的产物的途径。

综上所述，本研究中产生的知识可通过改变培养基配方、不良途径的遗传干预以及修改氨基酸和葡萄糖的补给策略，来调节哺乳动物培养物中分泌的副产品的积累，用于生物制造和其他应用。通过识别和调节分泌的副产物的积累，可以提高哺乳动物细胞在培养中的代谢性能和生理机能，特别是对于强化过程，并为生物技术和生物医学实施更强大的哺乳动物生物生产系统。

原文：Gonzalez, J. E., Naik, H. M., Oates, E. H., Dhara, V. G., McConnell, B. O., Kumar, S., Betenbaugh, M. J., & Antoniewicz, M. R. (2024). Comprehensive stable-isotope tracing of glucose and amino acids identifies metabolic by-products and their sources in CHO cell culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 121(41), e2403033121. https://doi.org/10.1073/pnas.2403033121