荧光 TCID50 测定法评估rAAV 生产过程中rBV清除率

背景

基因治疗是一种利用遗传物质（如DNA或RNA）来治疗或预防疾病的医学方法，基因治疗通常涉及将基因包装在载体中，以促进其进入靶细胞并为受影响的个体提供治疗益处。逆转录病毒（一种包膜 ssRNA 病毒）载体主要用于纠正从患者体内回收的血细胞中的默认基因，然后通过离体基因疗法重新输注，而腺相关病毒（AAV）载体则优先用于通过全身或局部基因递送影响特定器官（如大脑、脊髓或肝脏）的疾病。1998年至2022年期间，全球有255项使用AAV递送的临床试验，获得6项监管批准。迄今为止，已经开发了几种类型的重组腺相关病毒（rAAV）载体生产系统，包括使用人胚胎肾细胞（HEK293）和昆虫草地贪夜蛾（Sf9）细胞的系统。由于其辅助功能是 AAV 的DNA 高效复制所必需的，因此自2002年以来，杆状病毒（一种包膜dsDNA病毒）已被用于AAV生产。

在含有高滴度rBV的未加工收获物中，Sf9细胞系已被证明持续携带Sf弹状病毒（Sf-RV），这是一种包膜、负链和单链RNA（-ssRNA）病毒。显然，Sf-RV是昆虫特异性的，对哺乳动物和人类细胞系无感染性。然而，利用含Sf-RV的细胞系生产生物制剂会引发病毒安全风险，并在生产过程中清除病毒方面增加复杂性。为了消除与rAAV产品相关的潜在病毒安全风险，已经开发了病毒灭活和/或去除步骤的组合，并将其纳入AAV生产平台。这些步骤包括在细胞裂解过程中用十二烷基硫酸钠（Sarkosyl，SLS）和Triton X-100灭活rBV，通过AAVx亲和层析去除rBV，通过低pH保持灭活rBV，以及通过CsCl超速离心和病毒过滤去除rBV。每个步骤都经过评估，以确保最终rAAV产品的功能性、纯度和安全性。

荧光 TCID₅₀ （F-TCID₅₀） 测定法的开发

病毒感染性滴度通常表示为中位组织培养感染剂量（TCID₅₀），这足以在50%的含有指示细胞培养物的孔中引起可区分的细胞病变效应（CPE）。在Sf9细胞培养中，细胞附着在培养板表面并呈圆形。然而，与通过TCID₅₀ 测定检测哺乳动物病毒的基于细胞的病毒测定中观察到的可见CPE不同，杆状病毒诱导的Sf9细胞形态变化，例如细胞大小增加和活力降低，在常规光学显微镜下很难识别。因此，准确测定杆状病毒检测终点通常具有挑战性。为了克服这一检测障碍，罗宁光等人开发了一种荧光TCID₅₀（F-TCID₅₀）测定法，以此测定杆状病毒去除和灭活后重组杆状病毒（rBV）原种的感染滴度，并评估各种试剂和溶液对rBV感染性的影响。

研究者们在28°C下用携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组杆状病毒（rBV）接种Sf9细胞6-8天，以便在荧光显微镜下轻松观察感染细胞中的绿色病灶。具体步骤为：将Sf9细胞以4×10⁵ cell/ml和每孔50μl的密度接种在96孔板中。制备一系列用10^-1至10^-11的ESF AF培养基制成的rBV-GFP原液稀释液，并将每种稀释液50 μl添加到接种有Sf9细胞的板的每个孔中，从低到高，每根柱上的稀释度相同。将新鲜培养基加入最后一列的孔中作为阴性对照。将细胞在28°C下孵育6-8天，然后使用荧光显微镜评估GFP表达。如果检测到一个或多个指示rBV-GFP感染的绿色病灶，则A孔计为阳性。如果未检测到绿色病灶，则认为该孔为阴性。使用Spearman-Karber方程计算rBV-GFP原液的感染滴度。为了在AAV纯化过程中更准确地评估rBV-GFP加标样品中杆状病毒的感染性，在F-TCID₅₀测定中使用了1：3.2（而不是1：10）的连续稀释。

采用F-TCID₅₀评估 AAV 纯化平台中每个步骤中 rBV 的清除率

杆状病毒/Sf9细胞系统代表了迄今为止最先进的rAAV制造平台之一。尽管杆状病毒/Sf9细胞系统能够产生高滴度和高纯度的rBV，但有时会留下少量杆状病毒DNA污染，需要在临床应用前去除。此外，在 rAAV 载体的下游纯化过程中，去除和灭活重组杆状病毒以获得最大的治疗效果非常重要。为了这个目标，研究者开发了一种F-TCID₅₀ 测定法，以确定杆状病毒去除和灭活后rBV-GFP原液的感染滴度，并评估各种试剂和溶液对 rBV 感染性的影响。研究者采用F-TCID₅₀方法对试剂和溶液对Sf9细胞的毒性、试剂和溶液对Sf9细胞中rBV感染性的干扰、裂解和低pH处理过程中rBV失活的动力学研究、使用Amicon-4离心过滤装置更换缓冲液、AAVx亲和层析、CsCl超速离心和病毒过滤等处理步骤中残余的有活性rBV的清除率进行评估。

表 1 AvirmaxCMC AAV生产过程中rBV清除率

如表1所示，SLS和Triton X-100裂解、AAVx亲和层析、低pH值保持（pH 3.0）、CsCl超速离心和NFR过滤的组合导致重组杆状病毒的有效灭活和/或去除，并在整个 AAV 纯化过程中实现了超过18.9的LRV。这些数据提供了强有力的证据，证明实施的多个AAV纯化步骤足以去除和/或灭活rBV。

总结

本研究建立了检测rBV传染性的可靠F-TCID₅₀ 测定法，可广泛应用于使用杆状病毒系统的 AAV 生产；本研究还采用F-TCID₅₀方法评估AAV 纯化平台中每个步骤中有活性rBV的清除率。

关键发现

—建立了检测rBV传染性的可靠F-TCID₅₀ 测定法；

—采用F-TCID₅₀方法评估AAV 纯化平台中每个步骤中有活性rBV的清除率。

引用文献

Evaluation of recombinant baculovirus clearance during rAAV production in Sf9 cells using a newly developed fluorescent-TCID₅₀ assay.