多探针扩增（MPA）与熔化曲线分析:同时检测复杂样品中8种潜在的病原体

一、引言

生物恐怖主义制剂是故意释放病毒、细菌或其他用于导致人类、动物和植物生病或死亡的物质，导致环境退化和社会恐慌。随着科学技术的飞速发展，可以预见潜在的生物恐怖袭击可能会变得越来越突然、隐蔽和复杂。

多重检测是指在一次反应中同时识别两种或两种以上的病原体，从而实现有效和全面的筛查。这种方法不仅提高了检测效率，而且降低了实验成本。依赖于荧光探针的传统多重PCR技术受到荧光通道可用性的限制。一般来说，单个通道只能检测一个靶标，从而限制了PCR最多只能检测六个病原体靶标。使用非特异性荧光染料的熔融曲线分析广泛应用于各种应用，包括单核苷酸多态性分析、甲基化研究、基因突变检测和基因分型。然而，由于缺乏特定的识别能力，同一反应体系中只能使用一种荧光染料，这大大限制了其在检测多个靶标方面的应用。

二、多探针扩增（MPA）与熔化曲线分析

本研究使用了专门设计的探针组合（THO:PCO），结合多探针放大（multiprobe amplification，MPA）熔融曲线分析，突破了只能检测单一靶标的局限。通过荧光探针（fluorescent probe，THO）切割产生放大的信号，根据碱基组成和碎片长度具有不同的熔体温度，荧光探针与熔融曲线探针（melt curve probes，PCO）杂交产生特征熔融曲线。在一定范围内，不同的温度对应不同的四色荧光检测目标。温度和荧光形成对应于特定目标的二维锁定关系，使精确制作或精心构建特定的荧光阵列成为可能，具有高灵敏度和多目标放大检测的特点。

基于熔融曲线荧光阵列技术的MPA检测平台的整个过程包括三个阶段：样品制备、核酸提取和样品检测，其可以在一次反应中检测到多达8种目标细菌，包括炭疽杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、布氏杆菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、土拉菌、霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。

三、研究方法与结果

通过优化每种目标细菌的最佳plus探针浓度，对MPA体系进行优化。每种目标细菌的最佳plus探针浓度分别为炭疽芽孢杆菌（200nmol/L），鼠疫杆菌（100nmol/L），土拉菌（75nmol/L），布鲁氏菌（100nmol/L），假杆菌（100nmol/L），伤寒沙门氏菌（100nmol/L），霍乱弧菌（100nmol/L），金黄色葡萄球菌（100nmol/L）。

图1. 不同细菌的plus探针浓度优化

通过检测从细菌培养物提取的基因组DNA的连续稀释度来评估灵敏度，结果显示MPA法对炭疽芽孢杆菌、鼠疫杆菌、土拉菌、布鲁氏菌、假杆菌、伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌基因组DNA的敏感性分别为60 fg/μL、50 fg/μL、20 fg/μL、36.7 fg/μL、77.3 fg/μL、53 fg/μL、46.7 fg/μL、30 fg/μL，表明MPA法在低浓度条件下对8种潜在细菌生物恐怖剂具有稳定的检测能力。

图2. MPA 对8种目标细菌基因组DNA的敏感性分析

通过使用高输入浓度（100pg/μL）的其他8种细菌基因组DNA混合物并同时检测4种培养基（人血、人血清、拭子和土壤）的基因组DNA混合物来测试MPA方法的特异性。结果显示，在低输入浓度（100fg/μL）下，阳性对照（PC）对8种目标细菌基因组DNA表现出显著的信号变化。相比之下，蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、马氏芽孢杆菌、肠炎芽孢杆菌、副溶血性芽孢杆菌、创伤性芽孢杆菌和肉毒杆菌的信号变化低于检测其他8种细菌DNA混合物的临界值，此外，四种培养基的DNA混合物的检测结果也为阴性。结果表明，该方法可特异性检测出8种潜在的细菌生物恐怖剂，可用于复杂样品的后续检测。

图3. MPA对其他8种细菌基因组DNA和4种培养基的特异性分析  

采集24份人血清样本和24份拭子样本，以评估采用MPA方法的临床可行性。结果显示，MPA能有效识别中浓度（2×10⁴ CFU/mL）和低浓度（2×10² CFU/mL）的单一目标样品，显示出全面的检测能力。在涉及检测多种感染（多靶点）的模拟过程中，该方法可以准确地识别中低浓度的样品。

图4. 模拟人血清和拭子样本中单一和多重感染的验证

五、结论

该研究提出了一个高通量、多目标荧光阵列检测平台，有效地将多探针放大（MPA）与熔化曲线分析相结合，用于稳定检测8种潜在的细菌生物恐怖主义制剂，包括炭疽杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、布氏杆菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、土拉菌、霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。

参考文献：

Jianhao Xu, Jianping Wang, Bing Yuan, et al. Multiprobe Amplification (MPA) with Melting Curve Analysis: A Highly Stable and Cost-Effective Platform for the Simultaneous Detection of Eight Potential Bacterial Bioterrorism Agents in Complex Samples[J]. Analytical Chemistry, 2024, 96: 13679−13689.