可折叠的一体式即时护理分子诊断微设备的制造，可轻松识别多种病原体

目前，由有害细菌引起的食源性疾病是公众健康的主要威胁之一。因此，开发灵敏且快速的方法以检测食源性病原体始终是优先事项，也是设备商业化的推动力。即时检测（POCT）技术作为一种新型诊断工具正在发展，确保了灵敏度、特异性、便携性和用户友好性。在之前的研究中，一些完全集成的微设备已被用于细菌检测。例如一种PDMS-玻璃阵列芯片用于特异性检测多种水媒病原体的基因组DNA。该设备采用毛细管流进样，省去了执行器的使用，但制作过程复杂且需实时PCR仪读出结果。此外，还开发了一种完全集成的纸芯片，用于DNA提取和等温扩增，允许在芯片上存储干燥试剂，简化了核酸扩增过程。尽管微型装置具有优势，但仍然面临挑战，如器件制造和操作的简化，以及样品预处理步骤的复杂性。近年来，使用Whatman FTA卡简化了样品预处理过程，使其适用于小型平台。FTA卡能迅速灭活生物体，保护核酸不受损害，从而提高DNA提取效率。此外，PCR和等温扩增技术在食源性病原体的检测中发挥了重要作用。虽然PCR仍被视为金标准，但比色检测作为替代工具逐渐受到关注。

基于此，嘉泉大学的研究者提出了一种可折叠的一体化微型装置，集成了样品制备（DNA提取和纯化）、PCR扩增及硝酸银比色检测，旨在实现病原体的多重检测。该微器件的无仪器特性简化了后续扩增过程，能够快速同时识别三种主要食源性病原体：沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌。此外，我们还应用该装置对鲍曼不动杆菌进行鉴别，该细菌以其对碳青霉烯类抗生素的耐药性而闻名，是医院感染的主要病原之一。微型装置还可用于扩增bla_OXA-23基因，以快速识别耐药细菌。图1a展示了包含三层PMMA的微器件结构，其中顶层粘附有预先储存PCR试剂的纸盘。通过将顶层与中间层折叠，形成六个腔室以实现多重反应并行。图1b描述了使用整个细菌细胞进行DNA提取、扩增和检测的操作流程。在主室中加入3 μL菌液以提取DNA，随后进行PCR扩增，并使用商用热循环器进行热循环。最后，通过加入硝酸银溶液并紫外照射，实现目标DNA的快速肉眼检测。

图1 (a)由三层聚甲基丙烯酸甲酯塑料和纸盘组成的可折叠一体机微型装置的整体结构。(b)使用微设备进行FTA卡介导的DNA提取、PCR扩增和硝酸银检测的操作示意图。

研究人员利用FTA卡优化DNA提取。图2展示了多个参数对利用FTA卡分离DNA的最佳条件的影响，包括卡片尺寸、洗涤缓冲液（FTA试剂和TE）的用量、洗涤时间和次数。以沙门氏菌为实验对象，研究了FTA卡尺寸和洗涤缓冲液用量对分离效果的影响，并用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌检测洗涤时间和次数。凝胶电泳结果显示，使用3 μL细菌溶液进行PCR检测均成功；在不同尺寸的FTA卡中，2~3.5 mm的提取性能优于4.5 mm和5 mm的卡片。结果表明，当FTA卡尺寸从2 mm增加到3.5 mm时，目标波段强度略有下降，而4 mm和5 mm时则更明显。较大的FTA卡可能无法充分洗去所有抑制剂，且需要更多的洗涤缓冲液。为了减少占地面积和制造成本，选择了直径为2 mm的FTA卡。图2b和c显示了FTA纯化试剂和TE缓冲液用量的影响，结果表明10 μL的体积足以消除扩增抑制剂，这比制造商推荐的量低20倍。洗涤时间和次数也影响DNA提取效率。图2e显示了洗涤次数的影响，结果表明每个缓冲液只需清洗一次即可获得良好的提取效果。

图2 凝胶电泳结果显示了FTA卡提取DNA的最佳条件。(a) FTA卡尺寸的影响：1车道为负控制。巷2 - 3、巷4 - 5、巷6-7、巷8-9、巷10-11、巷12-13分别为直径为2、2.5、3、3.5、4、5 mm时的结果。(b) FTA纯化试剂用量对DNA提取效率的影响：Lane 1为阴性对照。通道2-10表示200、175、150、125、100、75、50、25和10 μL的体积。(c) TE缓冲液量的影响。车道1为阴性对照。通道2-10表示200、175、150、125、100、75、50、25和10 μL的体积。(d)洗涤时间的影响。车道1-2分别为阴性和阳性对照。图3-6显示了5、10、15和20分钟的持续时间。(e)洗涤次数的影响。车道1为阴性对照。图2-5显示了在（FTA纯化剂：TE缓冲液）比例为（2:2）、（1:2）、（2:1）、（1:1）的情况下，使用洗涤缓冲液洗涤的次数比。

检出限（LOD）是细菌检测中的关键因素。本研究针对沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌进行了检测，结果显示沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的PCR结果在100至105 CFU/样本范围内均成功（图3a和b）。LOD约为3.0 × 10¹ CFU/样品，基于在2mm FTA卡上添加的3 μL细菌体积。由于目标波段强度较低，后续实验选择了3.0 × 10² CFU/样品进行进一步检测。金黄色葡萄球菌的结果显示，LOD约为3.0 × 10² CFU/样品，后续实验选用3.0 × 10³ CFU/sample，以确保目标波段更清晰。值得注意的是，提取金黄色葡萄球菌的DNA较沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7更具挑战性，因为革兰氏阳性细菌的复杂细胞壁结构导致提取效率降低。使用FTA卡时，由于样品输入量小、分离时间短、步骤少，大幅提高了DNA提取效率，是实现POCT的关键标准。

图3 结果显示LOD。(a)沙门氏菌，(b)大肠杆菌O157:H7， (c)金黄色葡萄球菌。Lane NC为负控制。图1-6为输入细菌浓度为100 ~ 105 CFU/份时的扩增结果。所有的实验都重复了三次。

图4展示了使用硝酸银溶液（AgNO₃）在紫外线照射下对目标DNA进行比色检测的结果。PCR首先在试管中进行，然后转移至芯片上。图4a和b分别示意了硝酸银比色DNA检测的过程。当目标DNA存在时，加入硝酸银后，溶液呈现棕色；若未扩增DNA，则保持无色。这种颜色变化源于AgNPs在234 nm紫外线照射下的形成。如图4c-e所示，通过凝胶电泳和硝酸银比色法成功扩增了沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7三种食源性细菌。尽管溶液的棕色不均匀，但只要出现棕色即被视为阳性，因为阴性对照仍为无色。通过凝胶电泳交叉验证，颜色变为棕色表明目标DNA的存在。

图4 原理图显示了当(a)不存在DNA和(b)存在DNA时，使用硝酸银溶液和紫外线光照（234 nm）对PCR扩增子进行比色检测。检测(c)沙门氏菌、(d)金黄色葡萄球菌和(e)大肠杆菌O157:H7的凝胶电泳结果和比色光学检测。车道1为阴性对照。2-3车道显示阳性控制。

在可折叠一体机中完成了DNA提取、PCR扩增和直接片上比色检测，整个检测过程约需116分钟。 具体而言，FTA卡的DNA提取耗时40分钟，商业化热循环器的DNA扩增需75分钟，最后使用银溶液进行比色检测仅需45秒。 可折叠一体机的设计使得在顶层与中间层之间折叠后，可以将浸有PCR试剂的纸盘贴于顶层，以便进行后续的PCR反应。 在主腔室内，定制的扁平热块通过对流实现PCR过程中的温度均匀性，确保变性、退火和延伸等步骤的有效进行。 此外，使用干燥的PCR试剂在室温下保存一个月后仍能成功进行PCR反应。 特异性测试通过检查每组引物的跨种扩增结果得以验证。 微器件用铝带密封，以防止热循环过程中的蒸发，铝带在经历30个热循环后依然完整，显示出其优异的耐高温性和附着力。 因此，PCR过程后没有出现泄漏，微室中的PCR缓冲液清晰可见。 最终，通过凝胶电泳确认该微型装置能够高特异性地检测三种食源性致病菌，并且在牛奶样本中成功识别出沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7的存在。 这一成果表明，该可折叠一体机在乳制品中检测食源性细菌方面具有良好的应用前景

图5 （a-b）可折叠一体机的俯视图和侧视图。使用该微装置鉴定三种食源性病原体的芯片上结果。(c)密封微器件的铝带，防止热循环过程中蒸发。(d)培养液中三种食源性致病菌的芯片上鉴定结果。(e)在奶类样本中识别三种食源性致病菌的芯片结果。

研究人员应用可折叠一体机扩增多耐药鲍曼不动杆菌的bla oxa-23样碳青霉烯酶，以用于临床诊断。该研究从一位泰国住院患者身上分离了5株鲍曼不动杆菌，利用微装置检测bla oxa-23样碳青霉烯酶的存在。凝胶电泳结果显示，成功扩增出501 bp的基因片段（图6a），其中车道1为阴性对照。图6中的车道2至5显示了可能含有该酶的样本扩增结果，车道4至6清晰可见501 bp的靶基因，表明这些样本中存在bla oxa-23样碳青霉烯酶。然而，车道2和3未检测到目标带，表明这两株鲍曼不动杆菌缺乏该酶。此外，通过硝酸银比色检测的结果（图6b）显示，室1和室2为无色或弱褐色，而室3至5则呈深褐色，与PCR结果一致。这些发现表明，可折叠一体微装置在鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类基因的现场监测中具有有效性，为临床医生在决定是否给予患者碳青霉烯治疗提供了重要支持。

图6 利用可折叠一体机芯片检测多药耐药鲍曼不动杆菌是否存在bla oxa -23样碳青霉烯酶。(a)凝胶电泳结果。车道1为阴性对照。图2-6为5份含和不含bla oxa -23样碳青霉烯酶鲍曼不动杆菌样品的扩增结果。(b)结果显示基于硝酸银的比色检测。(c)主腔内分析的颜色强度。

本研究成功开发了一种可折叠的多功能微型装置，可以进行DNA提取，PCR扩增和基于硝酸银的比色检测，用于多重检测病原体。验证了FTA卡提取DNA的最佳条件，并成功地将预先储存有PCR试剂的纸盘用于用FTA卡纯化的DNA模板扩增目的基因。此外，基于硝酸银的比色法可以清楚地区分有和没有目标基因的样品。这种可折叠的一体机被证明可用于三种主要食源性病原体的多重检测，即沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157: h7，而无需在仪器外对样品进行预处理。该微型装置也被证明可用于鉴别含有鲍曼不饱和杆菌的临床样品中是否存在碳青霉烯类耐药基因，为构建一种简单的诊断工具铺平了道路，可以快速检测任何DNA相关的生物样品，并通过实时监测世界范围内的多药耐药病原体，阻止最后使用抗生素的过度使用。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.snb.2020.128057