智能包装实验室系统推进原位食品监测

随着对食品需求的增加及气候变化导致的病原体流行率变化，食源性疾病正日益成为全球公共卫生的重大挑战。尽管已有多种程序和监管措施旨在减少食品污染，但在生产过程中对所有食品进行检测仍然至关重要。特别是即食食品（RTE），由于缺乏烹饪步骤而更为脆弱。然而，当前行业标准的培养协议不仅昂贵且耗时。为了解决这些问题，多个现场检测平台已被开发，但这些系统往往会导致大量食品浪费，并假设所测试的样品能够代表整个批次。为了实现单个产品的监测，需要在包装中整合病原体传感器，这一方向已被多种传感技术探索。

基于此，麦克马斯特大学的研究者提出了一种创新的食品安全包装系统，包含一个新设计的食品包装托盘和膜接口，以满足特定目标。该“Lab-in-a-Package”平台通过整合病原体传感器，实现了单个包装内的监测。其设计的灵活性使得各种病原体传感平台能够有效结合。为满足特定需求，本研究还开发了一种针对鼠伤寒沙门氏菌的合成荧光核酸探针（FNAP）。该探针可作为鼠伤寒沙门氏菌RNase H2蛋白裂解的底物，通过荧光团-猝灭剂配对监测反应。将此探针与托盘和膜结合，形成完整的Lab-in-a-Package平台。我们对散装RTE鸡肉产品进行了人工污染实验，并在该传感器嵌入式包装系统中观察到高检测性能。此外，考虑到不同污染途径对食品病原体的影响，我们在被鼠伤寒沙门氏菌污染的烹饪器具和表面上暴露散装RTE鸡肉，并使用该平台进行监测，保持了良好的检测性能。最后，通过与智能手机连接的手持式荧光扫描仪模拟实际使用情况，成功检测目标而不破坏封闭包装。

图1 Lab-in-a-Package平台示意图。a）完整的Lab-in-a-Package原位检测平台，包括倾斜包装托盘、试剂饱和膜和传感器，如RTE鸡肉产品所示。成像程序包括荧光扫描也显示。b）倾角为45°至90°的食品包装托盘，以优化测试样品定位。c）用试剂组分描述膜饱和，缓冲组分和目标分析物向传感器表面扩散，防止结垢。d）FNAP传感器的开发，并进行相应的材料表面和生化修饰。

与传统包装相比，食品包装设计经历了显著变化，以增强传感器的可视化和样品流体的定位。新设计引入了一个传感窗口，使得在不打开包装的情况下也能进行荧光监测。同时，通过3D打印制造了三种不同倾斜角度的包装托盘（45°、60°和90°），以优化目标食物基质流体的定位。研究发现，90°模型在流体传递效率上显著优于其他模型（P < 0.01），因其更陡的角度产生了更强的向下加速度。然而，后续测试重点转向每个模型的定位效率。结果显示，45°模型在流体定位方面表现优异，显著高于60°（P < 0.001）和90°模型（P < 0.0001）。这种性能提升归因于45°模型在传感器窗口中提供了一致的流体下降。使用PBS和鸡清洗液评估流体定位时，45°模型再次显示出明显优势（P < 0.001）。

在膜界面研究中，评估了五种候选材料的缓冲吸收、大分子过滤和靶扩散特性。考虑的材料包括棉花、棉花纤维素、纤维素、纤维素-聚酯和聚酯，因其优良的生物相容性和渗透性。通过光学显微镜和扫描电子显微镜对这些材料进行成像，发现棉花由于其独特的卷曲纤维结构，表现出较大的气孔。所有材料在可见光光谱上均显示低荧光，进一步表征确认了其对荧光系统的适用性。棉纤维素在吸收能力测试中显著优于其他材料，这归因于其丰富的羟基和较高的亲水性。随后，研究还评估了不同材料在封闭包装环境中的缓冲液保留情况，结果显示所有候选材料在120 h后的液体体积变化有限。扩散测试表明，聚酯膜、纤维素-聚酯膜和棉膜在初步缓冲扩散研究中表现最佳。通过细菌扩散实验，棉花在不饱和和饱和状态下均显示出优越的扩散性能。

图2 基于应用相关特性的包装模型和候选膜的表征。a）所有包装模型的CAD模型，显示顶部、底部和正交视图。b）水滴落在包装边缘所需的时间。c）以0.5 mL s⁻¹的速率配药时，5 ml缓冲液到达传感窗口所需的时间。d）以0.2 mL s⁻¹的速率分配时，1 min后原始PBS体积在传感窗口定位的百分比。e）在37°C下加热24 h后，原鸡净化体积定位的百分比。f）候选膜在100×下的扫描电镜图像，覆盖在500×下。g）候选膜的平均背景荧光。h）候选膜的吸收能力。i） 2 min后缓冲液通过候选膜扩散的体积。j）与大肠杆菌孵育6 h后膜对细菌生长的影响。k,l）细菌通过不饱和（k）和缓冲饱和（l）膜扩散到底物上，与大肠杆菌在37°C下孵育6 h）与鼠伤寒沙门氏菌孵育6 h后膜对细菌生长的影响。n,o）鼠伤寒沙门氏菌在37°C下孵育6 h后，细菌通过不饱和（n）和缓冲饱和（o）膜扩散到底物上。

随着封装和膜优化的完成，研究人员寻求将兼容的传感器纳入开发的平台。尽管之前已报道了针对大肠杆菌的实时荧光传感器，但由于对鼠伤寒沙门氏菌污染的关注，团队开发了一种新的传感器。利用配体的系统进化指数富集（SELEX）技术，研究人员从鼠伤寒沙门氏菌中鉴定出一种高灵敏度的核酸探针，该探针在RNase H2存在下能够裂解。该探针与嵌入荧光团-猝灭剂配对的底物链杂交，鼠伤寒沙门氏菌诱导的裂解使猝灭分离并增强荧光信号。

传感器通过将FITC标记的探针共价附着在聚乙烯食品包装基质上而开发。探针表面密度优化为1.3 × 10⁻⁵ nmol/阵列点。随后，评估了该传感器在受污染鸡肉样品中的灵敏度、稳定性和特异性，结果显示其检出限为10³ CFU mL⁻¹，且荧光信号明显高于对照组。传感器在不同细菌浓度下呈现出良好的线性工作范围（R² = 0.98, P < 0.001），并在4、25和45°C下评估功能，结果表明在45°C下保持良好性能。

图3 鼠伤寒沙门氏菌传感器的开发与测试。a）鼠伤寒沙门氏菌反应性核酸探针在食物基质中的裂解活性示意图，以及相关的预裂解、裂解和猝灭分离状态。b）用细菌稀释液对核酸探针进行敏感性测试，并用100 μm比例尺进行相关图像检测。c）细菌种类为10⁷和10⁵ CFU mL−1的核酸探针在4、25、37和45℃时的温度分布。d）核酸探针在底物表面的共价附着确认。e）在4°C下保存3个月后，用10⁶ ~ 10³ CFU mL−1的细菌测试研制的传感器的稳定性测试。f）核酸探针在10⁶ CFU mL−1条件下使用各种细菌进行特异性测试，并使用¹⁰0 μm比尺进行相关图像检测。

研究人员将新开发的FNAP传感器集成到Lab-in-a-Package平台中进行测试。最终的原位检测平台包括一个倾斜45°的凹包装托盘和一个传感窗口，窗口中嵌入了针对鼠伤寒沙门氏菌的实时荧光传感器，以及相邻的缓冲注入棉膜。由于鸡肉在490 nm/525 nm的FITC发射/激发波长处存在显著的荧光噪声，研究团队转而使用TAMRA荧光团标记的探针，激发和发射波长为557 nm/576 nm。该酶促寡核苷酸探针的活性依赖于二价金属离子的存在，因此需要缓冲固定膜。开发的鼠伤寒沙门氏菌反应探针对Mg²⁺离子表现出优异性能，这限制了缓冲液从膜中浸出到邻近食物中。经过优化，Lab-in-a-Package平台中的MgCl₂离子浓度达到30 mM。将RTE烤鸡产品放置在托盘中，并加入鼠伤寒沙门氏菌污染的鸡清洗液进行敏感性分析，浓度范围为10⁶至10² CFU g⁻¹。在37°C下孵育8 h后，传感器在污染样品中的平均倍数变化显著高于对照组（P < 0.0001），检出限为10³ CFU g⁻¹。线性回归分析显示，该系统具有良好的线性工作范围（R² = 0.98, P < 0.05）。

研究人员进行了一项细菌生长研究，以评估Lab-in-a-Package平台提高灵敏度的潜力。结果显示，在鸡净化液中，鼠伤寒沙门氏菌在4 h内从10² CFU mL⁻¹增长至10⁴ CFU mL⁻¹，表明延长潜伏期可以提高检测限。研究还通过将FNAP传感器与常见食品污染物混合物孵育，评估平台的特异性。具体而言，传感器与10⁶ CFU g⁻¹的大肠杆菌O157:H7和单核增生乳杆菌混合污染的鸡样品一起孵育，结果鼠伤寒沙门氏菌样品的平均倍数变化为2.70，显著高于对照组的1.25（P < 0.0001）。

为了进一步确认系统的特异性，研究人员进行了目标验证实验。经过8 h孵育后，选择性镀上尖刺并定位在传感窗口上的样品之间没有显著差异。这些结果表明，该包装平台成功地将测试溶液定位到传感界面上，同时具备一定的灵敏度和特异性。随后，该平台用于模拟真实世界的食品污染，通过接触被污染的刀、手套和表面，将10⁷ CFU g⁻¹的溶液添加到鸡肉样品中，结果显示出显著的高平均倍数变化，进一步验证了该平台在实际环境中的可行性。

图4 Lab-in-a-Package平台开发和测试。a）基于fnap的鼠伤寒沙门氏菌原位检测界面示意图。b）包装平台组装图像，包括：i）传感器植入传感窗口，ii）膜掺入，iii）食品加入包装。比例尺代表3厘米印刷包装托盘。c）鸡净化液在四个荧光波长下的固有荧光。用灰色方框表示覆盖棉膜的平均荧光值。d） MgCl2膜吸收扩散的浓度优化。e）对受污染的全鸡样本进行现场全平台测试后的敏感性测试，并附有100 μm比尺的相关图像。f）食品污染来自i）各种污染途径，引入ii）在生产过程的各个阶段。g）利用Lab-in-a-Package平台原位诱导真实世界污染检测。h）手持式荧光扫描仪实验装置的光学图像，附带智能手机读数。i）使用FNAP传感器检测鼠伤寒沙门氏菌，使用手持扫描仪可视化，并与3.33 mm比例尺相关图像。j） Lab-in-a-Package中鼠伤寒沙门氏菌的手持式荧光检测，附带3.33 mm比例尺的传感器图像。所有报告的值代表所有样本的平均值，误差条代表平均值的标准误差。所有星号表示相应显著水平上的显著差异。（a）和（f）是使用BioRender.com创建的

本研究成功开发了一种新的对鼠伤寒沙门氏菌高度特异性的合成荧光核酸探针（FNAP）。该探针作为鼠伤寒沙门氏菌RNase H2蛋白裂解的高度特异性底物，可以通过将荧光团-猝灭剂配对整合到FNAP结构中来监测这一反应。将新发现的探针与托盘和膜结合，形成了完整的Lab-in-a-Package平台。人工污染的散装RTE鸡肉产品随后被储存在该传感器嵌入式包装系统中，其中观察到高检测性能。其次，认识到不同的污染途径以不同的方式将病原体定位在食品上，散装RTE鸡肉产品暴露于被鼠伤寒沙门氏菌污染的烹饪器具、手套和表面，随后使用实验室-包装进行监测。该平台保持了较高的检测性能。最后，使用带智能手机连接的手持式荧光扫描仪全面模拟了该平台的实际使用情况，其中成功检测到目标，而不会破坏封闭包装。

论文链接：https://doi.org/10.1002/adma.202302641