比例电化学侧流免疫分析法检测猪链球菌血清型2

作为一种重要的人畜共患病原体，猪链球菌可引起脑膜炎、心内膜炎及中毒性休克等疾病，甚至导致人类永久性听力丧失。根据其荚膜多糖抗原，猪链球菌被分为35种血清型，其中血清2型对人类和猪的毒性最强，致病性最广。因此，迫切需要开发一种简单、快速且灵敏的检测方法来诊断猪链球菌血清2型感染。传统的细胞培养技术虽然可以鉴定猪链球菌，但过程繁琐且准确性不足。为了克服这些限制，许多分子生物学技术相继被开发。这些方法在复杂样品基质中表现出较高的灵敏度和特异性，但也存在耗时、操作复杂和设备昂贵等局限，不适合现场诊断。生物传感器因其反应速度快、灵敏度高、便携性强和操作简便等优点，在细菌检测领域受到广泛关注。横向流动免疫分析法（LFIA）作为一种生物传感器，以其灵敏度高、选择性强和检测时间短等优势，但传统LFIA方法仍面临灵敏度和重复性差的问题，因此电化学检测逐渐受到关注，并与LFIA结合用于定量检测。比率式电化学免疫传感器通过双电化学信号测量信号比值，有效提高了目标检测的再现性和准确性。这些创新为猪链球菌的快速检测提供了新的思路和方法。

基于此，朱拉隆功大学的研究者提出了一种结合LFIA （R-eLFIA）的比例电化学法测定猪链球菌血清2型的方法。该R-eLFIA采用双工作丝网印刷石墨烯电极（SPGE），通过修改二茂铁羧酸（Fc）和落日黄（SY）两种信号指标构建，并与侧流纸色谱试纸条集成（如图1所示）。使用Adobe Illustrator CC设计双工SPGE图案，如图1A所示。设计的SPGE由四个电极组成：工作电极1（WE1）、工作电极2（WE1）、对电极（CE）和参比电极（RE）。图1B和图C分别为R-eLFIA的组成和完成的d R-eLFIA图片。

摘要图1 （A）研制的猪链球菌血清2型检测R-eLFIA的原理图及(B) R-eLFIA的原理。

利用扫描电子显微镜（SEM）对不同修饰电极的表面形貌进行了表征。未经改性的SPGE表面显示出不同尺寸的石墨烯薄片，表面较为粗糙。经过Fc和SY修饰后，SPGE的表面变得相对光滑，这归因于这两种氧化还原物质在电极上的均匀分散。为了验证Fc和SY对SPGE的改性效果，研究人员采用能谱分析技术评估了Fc-SPGE和SY-SPGE的化学成分。结果显示，Fc-SPGE中存在碳(C)、氧(O)和铁(Fe)，而SY-SPGE中检测到了氮(N)、钠(Na)和硫(S)，这表明SY成功地修饰了SPGE。此外，通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析了裸SPGE、Fc-SPGE和SY-SPGE的结构。与裸SPGE相比，Fc-SPGE在478 cm⁻¹处出现了Fe-C特征峰，在1280 cm⁻¹和1647 cm⁻¹处分别对应于羧酸团体的伸缩振动，而在1471 cm⁻¹处的峰值则对应于芳烃的C-C伸展振动。对于SY-SPGE，其光谱中3429 cm⁻¹、1618 cm⁻¹、1503 cm⁻¹和1118 cm⁻¹处的拉伸振动分别对应于N-H、N-N、C-C和O-S-O的伸缩模式。这些表征结果表明，Fc-SPGE和SY-SPGE已成功制备。

图 1 (A)双丝网印刷电极示意图。(B)用LFIA设置的双丝网印刷电极的照片和(C)完整的R-eLFIA装置。(D) (a) SPGE, (b) Fc-SPGE, (c) SY-SPGE的SEM图像。(E)不同材料修饰电极的FTIR光谱。

研究人员对两种氧化还原反应的电化学性质进行了表征。结果显示，SY修饰的SPGE在0.67 V vs. Ag/AgCl处出现了清晰的氧化峰（曲线a），表明SY的氧化反应。相对地，Fc修饰的SPGE在0.34 V vs. Ag/AgCl处观察到峰值（曲线b），这归因于Fc在电极表面的氧化反应。通过对双工作电极的测试，分别在0.34 V和0.67 V处获得了Fc和SY的氧化峰（曲线c），验证了两种电活性物质成功修饰SPGE。为了验证比率策略的概念，研究人员在相同条件下测试了五个制备好的器件，并记录了SWV响应。对于单一信号响应的五个电极，IFc和ISY的相对标准偏差（RSD）分别为22.7%和26.1%。使用比例检测时，RSD值降至5.90%，显示出重复性提高了3.8倍。这些结果表明，该方法显著提高了eLFIA的重现性，有效克服了不同批次间的影响。

图 2 (A)单次运行(A) SY、(b) Fc和(c)两种氧化还原物质的SWV信号。(B)五个制备的eLFIA装置的SWV响应和(C)重复性数据。(D) R-eLFIA的比率电流响应。

研究人员利用SWV和EIS技术验证了所提出传感器的可行性和结构。结果显示，未修饰的SPGE在SWV响应中无明显峰值（曲线a）。当对电极进行Fc和SY修饰时，分别在0.34 V和0.67 V vs. Ag/AgCl处观察到特征峰（曲线b），表明Fc和SY的氧化反应。将猪葡萄球菌抗体固定在Fc-SPGE表面后（曲线c），Fc的峰值电流下降，而电流信号基本保持不变，这表明抗体形成了电子阻断层，抑制了电极表面的电化学反应。

当用1 × 10⁷ CFU/mL的猪链球菌检测AbsFC-SY-SPGE时（曲线d），Fc的峰值电流显著降低，而SY的电流信号保持不变，证实了R-eLFIA的成功制备。EIS分析显示，裸SPGE的电子转移电阻（Rct）为14.8 kΩ（曲线a），经过Fc和SY修饰后，Rct降低至7.44 kΩ（曲线b）。固定抗体后，Rct值分别增加至9.32 kΩ和11.5 kΩ（曲线c和d），表明生物分子的引入确实阻碍了电子转移。这些结果进一步验证了构建的R-eLFIA用于猪链球菌检测的可行性。

图 3 (A)在含有0.025% v/v Tween 20和0.1% w/v BSA的0.1 M PBS中获得的(A) SPGE、(B) FC-SY-SPGE、(c) Abs- FC-SY-SPGE和(d) S. suis -Abs- FC-SY-SPGE（以1 × 10⁷ CFU/mL S. suis血清型2检测）的SWV曲线和(B) Nyquist图。图(B)表示等效电路。Rs：电解液电阻，Rct：电子转移电阻，Cdl：双层电容，Zw: Warburg阻抗。

在优化条件下，研究人员通过检测不同浓度的猪链球菌血清2型来评估R-eLFIA的性能。结果显示，随着S. suis浓度的增加，Fc的氧化电流逐渐降低，而SY的电流响应保持恒定（图4A），这表明该传感器在定量检测猪链球菌血清2型方面具有较高的准确性和重复性。图4B展示了Δ电流比（IFc/ISY）与猪链球菌血清型2的对数浓度之间的良好线性关系，浓度范围为10²至10¹⁰ CFU/mL（Δ(IFc/ISY) = 0.3301logC + 0.0886, R² = 0.9978）。检测限（LOD）为10 CFU/mL，而定量限（LOQ）为5 × 10³ CFU/mL。与以往方法相比，R-eLFIA在灵敏度和分析时间（15 min）上均表现出优势，且其LOD值低于之前发表的LFIA研究（Ju et al., 2010；Nakayama et al., 2014）。此外，该方法提供了更高的再现性，重复性为6.72%（图4C），稳定性达到7天（图S5）。选择性研究表明，该装置对其他细菌和人类血清中的干扰具有高度特异性（图4D），进一步证明了R-eLFIA在猪链球菌血清2型检测中的优越性能。

图 4 (A) R-eLFIA对不同浓度猪链球菌血清型2的SWV反应：0 ~ 1 × 10¹⁰ CFU/mL。(B) Δ电流比（IFc/ISY）和猪链球菌血清2型浓度图。(B)为猪链球菌血清2型的对数校准曲线。(C) R-eLFIA的重复性试验，(D)该生物传感器对猪链球菌血清型2的选择性。

本研究成功开发了一种快速、准确检测猪链球菌血清2型的比例电化学侧流免疫分析法（R-eLFIA）试纸条。利用基于双电化学信号检测的比例策略可以提高R-eLFIA的重现性，与单电化学信号相比提高了3.8倍。在最佳条件下，该传感器可在15 min内检测出猪链球菌血清2型，最低检出限为10 CFU/mL。此外，利用VH抗体的优势，该生物传感器在应用于人类血清样品时显示出高特异性和准确性。因此，该R-eFLIA有可能成为诊断人类猪链球菌血清2型感染的新平台。尽管该传感器在血清样本中存在局限性，但尚未有任何关于在动物样本中检测猪链球菌血清2型的传感器的报道。该传感器可作为开发用于动物样本中猪链球菌血清2型检测的传感器的平台，用于传染病的诊断、预防和管理。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115742.