基于光电化学溶液门控石墨烯场效应晶体管的酶联级反应检测有机磷农药

摘要:

溶液门控石墨烯场效应晶体管(SGGT)因其出色的生物传感性能而广受关注,但在检测小分子时存在信号强度不足的问题。本文报道了一种创新的光电化学溶液门控石墨烯场效应晶体管(PEC-SGGT),通过构建酶联级反应系统实现了对有机磷农药的高灵敏检测。PEC-SGGT将CdS量子点作为光敏材料,并在电极表面修饰乙酰胆碱酯酶(AChE)和CuBTC纳米酶,形成一个酶联级反应检测机制。该系统中,AChE催化反应产生的硫代胆碱与CuBTC结合,抑制CuBTC对邻苯二胺(oPD)的氧化催化,从而影响oPD寡聚物在电极表面的沉积。有机磷农药的存在会抑制AChE活性,改变oPD寡聚物的沉积量,进而调控PEC电极的光电压,最终通过PEC-SGGT实现高灵敏的检测。通过对PEC电极性能和酶联级反应的系统研究,PEC-SGGT器件展现出了出色的性能,检出限达到0.05 pM,远优于传统的电化学传感器。这一创新工作为利用光电化学效应构建高灵敏度的小分子检测传感器提供了新思路。

1. 引言

高性能生物传感器的研发一直是现代生命科学和生物电子学领域的持续目标。溶液门控石墨烯场效应晶体管(SGGT)作为一种集成生物电子传感器,凭借其出色的优势引起了广泛关注。与传统硅基场效应晶体管不同,SGGT的导电通道由单层石墨烯组成,全面暴露的碳原子以及高载流子浓度和迁移率使其对周围电场变化极为敏感。这种固有特性使石墨烯成为构建高性能传感器的理想平台。尤其值得关注的是,SGGT可通过调节栅极电压极性实现线性的p型和n型输出特性,这为其作为生物传感信号放大器提供了可能。在溶液门控作用下,SGGT仅需±1 V的栅极电压范围即可正常工作,使其具备在低电压(<1 V)下进行生物信号放大的能力。同时,界面上的离子-电子电化学相互作用建立了生物信号与电子信号的高效转换桥梁。目前,SGGT已成功检测到葡萄糖、乙酰胆碱、阿片类药物、抗生素以及多种疾病生物标志物等。在检测特异性识别的大分子,如蛋白质、单碱基错配的DNA序列,乃至细菌和病毒等病原体时,SGGT展现出了极高的灵敏度,检出限可达到飞摩尔(fM)级。但SGGT的电解质门控调制依赖于待测物的电荷量和/或氧化还原性质,而大部分小分子呈中性并具有较弱的氧化还原性,这就需要在SGGT的检测原理中引入新颖的物理化学机制,构建精确高效的小分子识别策略,这在拓展场效应晶体管应用方面具有重要意义。

有机磷(OPs)农药因其高神经毒性而广泛应用于农业害虫管控,但其在生态循环系统中的潜在累积已引起广泛关切。OPs会与乙酰胆碱酯酶(AChE)活性位点的关键丝氨酸残基共价结合,转移磷酰基,使AChE无法有效催化乙酰胆碱的水解。因此,OPs在人体内的累积会对胆碱能神经元造成不可逆的损害,引发各种神经系统疾病,对人体健康构成严重威胁。因此,迫切需要开发快速、可靠、经济的OPs检测技术。先前的研究证实利用SGGT传感器检测OPs是可行的,主要采用酶活性抑制的策略,即将AChE修饰在SGGT的导电通道上,通过测量AChE催化乙酰硫胆碱(ATCh)生成的硫代胆碱(TCh)的电催化氧化电流来推断OPs浓度。尽管TCh氧化电流可以准确反映OPs浓度,但其分辨率受限于AChE催化效率和TCh氧化电极动力学的缓慢性,导致信号分辨率并不理想。此外,TCh的氧化电位较高(高达~0.8 V vs Ag/AgCl),需要在较高的栅极电压下进行检测,这可能超出SGGT线性工作区,进而引起检测结果的不确定性。因此,开发高性能SGGT生物传感器需要引入新颖的栅极信号触发模式,理想情况下该模式应能在低栅极电压下产生足够强度的目标分子信号,且信号强度独立于电化学反应动力学。

光电化学(PEC)作为一种新兴且富有前景的技术,近年来引起了广泛关注。PEC天然地结合了电化学和光分析技术的优势。利用创新的光驱动电化学信号检测模式,PEC可以摆脱电极氧化还原电位的限制。更重要的是,PEC利用光来激发信号并通过电流传输,信号激发源与传输介质的自然差异确保了响应信号的准确性。到目前为止,基于PEC信号识别和输出机制,已经开发出一系列具有高灵敏度和准确性的PEC传感器。凭借这些优势,将PEC整合到SGGT中建立新型高性能传感器或许是解决SGGT局限性的可行方案。

基于上述考虑,本研究提出了一种创新的光电化学溶液门控石墨烯场效应晶体管(PEC-SGGT)。为此，作者制备了特殊功能化的PEC电极作为SGGT的栅极。在该电极上,CdS量子点(QDs)作为光敏层,AChE和铜金属有机框架(CuBTC)纳米酶作为分子识别报告层,通过酶联级反应实现对有机磷的检测。PEC-SGGT传感器的检测机理基于巧妙的oPD级联聚合策略:CuBTC催化和氧化oPD生成oPD寡聚物,这些寡聚物在电极表面形成沉淀,影响PEC电极的门控效率;而AChE催化产生的TCh与Cu-BTC配位,抑制Cu-BTC的催化氧化活性,从而调控oPD的氧化聚合过程。此外,作为对有机磷农药(OPs)的初始响应,AChE活性会被OPs抑制,从而影响门控效率,可由SGGT精确反映。PEC-SGGT传感器的两大创新在于:首先,利用PEC作为SGGT的门控机制,引入了全新的门控模式;其次,巧妙地采用Cu-BTC纳米酶捕获AChE的催化产物TCh,将催化速率控制的PEC反应转变为时间累积的空间阻碍PEC反应,在降低触发栅极反应所需电压的同时,解决了催化速率低导致灵敏度不足的问题。最终,本研究制备的PEC-SGGT器件展现出对OPs浓度高达0.05 pM的超灵敏检测能力,为小分子超灵敏检测提供了高效可行的策略。

2. 结果与讨论

2.1 材料表征

实验中,CdS QDs作为PEC-SGGT系统中的光敏材料。TEM图(图2a)显示CdS QDs呈准球形纳米颗粒形貌,直径约6-7 nm,晶格条纹0.335 nm对应CdS的(111)晶面。EDS结果证实CdS QDs中存在S和Cd元素(图S4)。XRD结果表明所合成的CuBTC具有良好的晶体结构(图S5),一系列特征衍射峰与其晶面指标吻合。SEM图清楚地揭示了CuBTC的典型八面体结构(图2b-f)。EDS元素映射显示CuBTC晶体由C、Cu和O元素组成(图S6,S7)。FT-IR谱图进一步证实了Cu-BTC的结构特征(图S8)。N2吸附-脱附等温线表明CuBTC具有典型的I型微孔结构,比表面积和平均孔径分别为1259.3 m² g⁻¹和1.142 nm(图S9)。综合表征结果证实了CdS QDs和CuBTC的成功制备。

2.2 酶联级反应体系的建立

酶联级反应系统的基本原理和核心功能是建立CuBTC催化oPD氧化能力与AChE活性之间的相关性。因此,首先需要研究CuBTC对oPD催化氧化的行为特征。如图S10所示,oPD在CuBTC催化氧化下随时间变化的荧光响应,初始增加后减少,35 min时达到峰值。但UV-vis吸收结果(图S11)表明,反应55 min时的吸收明显高于35 min,这是oPD催化氧化反应的特点。CuBTC催化oPD的氧化过程分两步:首先,CuBTC表现出过氧化物活性,催化oPD单体氧化产生oPD寡聚物(DAP);随后,在CuBTC的孔道作用下,生成的oPD寡聚物通过π-π堆积和静电相互作用发生自聚集,形成oPD聚合物纳米颗粒。oPD聚合物纳米颗粒具有强吸光性,但荧光能力明显低于oPD寡聚物。据此,后续实验中将oPD催化氧化时间设为35 min。

AChE活性调控oPD沉淀产物生成是实现酶联级反应的前提。图2h,i显示了CuBTC与AChE酶联级反应的有效性和特异性。只有同时存在AChE、ATCh、CuBTC和oPD,才能启动完整的酶联级反应。如图S12所示,oPD沉淀的荧光强度与AChE活性呈正比,荧光强度变化率((F0-F)/F0)与AChE活性浓度呈线性负相关(图S12b)。这一重要发现为构建PEC栅极电极及其对OPs的检测能力奠定了基础。

2.3 酶联级反应对PEC的调制

图2j显示了共修饰有CuBTC和AChE的PEC电极(CdS/CuBTC/AChE PEC电极)在酶联级反应各阶段的光电流响应。PEC测试在含0.1 M TEOA作为电子供体的PBS(7.0, 0.1 M)电解质中进行。PEC电极在阶段I表现出最强的光电响应,产生最高光电流。在oPD溶液中孵育后(阶段II),电极光电流显著下降,表明CuBTC催化氧化形成的oPD沉积严重影响了光电流响应。经ATCh和oPD连续孵育后(阶段III),光电流明显恢复,说明AChE催化产生的TCh抑制了CuBTC的催化能力,终止了oPD沉淀的形成。相反,引入OPs后,AChE活性被抑制,无法引发酶联级反应(阶段IV),oPD仍会被CuBTC催化氧化形成沉淀,抑制光电子传输,导致光电流降低。可见,OPs可通过调控oPD沉淀的产生来精准控制酶联级反应的"开-关"切换,这也可通过电极阻抗的变化(图2k)得到验证。

2.4 PEC-SGGT器件的构建及性能

首先评估PEC栅极电极调制SGGT的能力,如图1a所示将制备的CdS PEC栅极与石墨烯导电通道集成。使用的支持电解质为含0.1 M TEOA的PBS(7.0, 0.1 M)。如图3a所示,PEC-SGGT器件在光照条件下展现出明显的双极性特性,证明PEC电极的光电压调制能力。在负栅极电压(Vg<0)下,器件工作于n型模式,光照会增强器件电导;而在正栅极电压(Vg>0)下,器件工作于p型模式,光照会减弱器件电导。此外,PEC-SGGT器件对光照和栅极电压的响应在较宽的电压范围内均显示出良好的线性关系(图3b,c)。这些特性为传感器应用奠定了基础。

将PEC电极与SGGT集成后,结合酶联级反应,可实现对OPs的高灵敏检测。如图4a所示,在无OPs存在下,AChE将ATCh水解产生的TCh与CuBTC结合,抑制CuBTC对oPD的氧化,从而减少oPD聚合物在PEC电极上的沉积,使PEC电极的光电流保持较高。而引入OPs后,AChE活性被抑制,TCh生成减少,CuBTC的催化活性不受抑制,oPD被氧化并沉积在电极上,PEC电极的光电流明显降低。如图4b所示,PEC-SGGT传感器对OPs(甲基对硫磷)浓度具有极高的灵敏度,检出限达0.05 pM,这远远优于传统电化学OPs传感器(表S1)。同时PEC-SGGT器件对OPs浓度的检测响应呈现良好的线性关系(图4c)。这种超灵敏的OPs检测性能得益于PEC电极光驱动的信号放大机制以及酶联级反应的高效信号响应。

3. 结论

本工作成功构建了一种基于光电化学溶液门控石墨烯场效应晶体管(PEC-SGGT)的高灵敏有机磷检测传感器。PEC栅极电极采用CdS量子点作为光敏层,AChE和CuBTC纳米酶构建了响应敏感的酶联级反应机制。该酶联级反应能够精准调控PEC电极的光电流响应,从而实现对有机磷浓度的超灵敏检测,检出限达0.05 pM。这一创新性成果为发展小分子检测的高性能生物传感器提供了新思路,为保护生态环境和人体健康做出重要贡献。

参考文献

H.-R. Wang, E.-H. Hou, N. Xu, Y.-F. Zhang, J.-F. Wu, W.-J. Yuan, Z.-G. Kong, P. Nie, L.-M. Chang, X.-L. Zhang, J.-W. Xie, Photoelectrochemical Solution Gated Graphene Field-Effect Transistor Functionalized by Enzymatic Cascade Reaction for Organophosphate Detection. Small 2024, 2402655. https://doi.org/10.1002/smll.202402655