单增李斯特菌是一种重要的食源性病原体，可引起严重的食品安全问题。早期监控和控制单增李斯特菌的传播对于降低李斯特菌病爆发的风险至关重要。传统的检测方法依赖于长时间的培养和生化分析，而分子诊断技术如聚合酶链反应（PCR）和实时荧光PCR被广泛应用于早期监控和流行病学调查。随着诊断技术的快速发展，需要更准确、更快速的检测方法来满足现场快速检测（POCT）的需求。

环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新兴的核酸扩增技术，具有操作简便、反应速度快、特异性强等优点。LAMP技术已被广泛应用于多种病原体的检测中，展现出良好的应用前景。近期研究表明，来自古菌Pyrococcus furiosus的Argonaute（Pf Ago）核酸酶具有高效的DNA切割活性，能够识别并切割与引导链完全互补的DNA目标序列。 Pf Ago系统已被应用于多种核酸检测平台，如PAND、RADAR、A-Star和MULAN等，实现了高灵敏度和特异性的核酸检测。本研究创新性地将LAMP与Pf Ago系统相结合，构建了一种用于单增李斯特菌现场检测平台。该平台结合了LAMP的高效扩增能力和Pf Ago高灵敏、高特异的检测能力，实现了快速、准确、便携检测的目的。

研究中使用了特定的试剂、质粒和食品来源的样品，用于验证LAMP-PfAgo检测系统的性能。通过提取食品样品中的DNA，分别使用LAMP-PfAgo荧光检测法、LAMP-PfAgo侧向流动试纸法（LFS）和定量PCR（qPCR）进行验证。所有反应均重复三次，以确保结果的可靠性。

LAMP-PfAgo系统的核心由三个短的5'-磷酸化单链gDNA引物和核酸内切酶Pf Ago组成，形成Pf Ago/gDNA复合物，与目标DNA结合并切割。这种方法具有高特异和高灵敏的特性。通过与其他病原体的对比实验，证明了LAMP-PfAgo荧光检测法和LFS法在特异性方面表现良好，无交叉反应。在18个样品中，有3个样品被检测出单增李斯特菌阳性，表现出强烈的荧光信号，而其他15个样品为阴性，荧光信号较低。LFS法的结果与荧光法和UV/蓝光观察结果一致。

尽管PCR和实时荧光PCR等方法具有广泛的应用，但它们需要专业的实验室操作人员、先进的设备和较长的反应时间，不适合现场便携式检测。LAMP-PfAgo技术结合了LAMP的有效扩增和Pf Ago的单碱基分辨率，以及优化的Mn²⁺浓度，表现出比CRISPR/Cas系统更优越的稳定性和性能。LAMP-PfAgo系统提供了一种新颖、高效、准确且易于操作的检测方法，有潜力在临床中得到应用，特别是在POCT领域。

本研究成功地将LAMP与Pf Ago/gDNA系统结合，开发了一种新的L. monocytogenes检测方法。该方法具有高特异性和高灵敏度，且易于操作，适合现场检测。随着技术的进一步发展和优化，LAMP-PfAgo系统有望成为食品安全领域和临床检测中的一种重要工具，为L. monocytogenes的快速、准确检测提供新的解决方案。

具体细节补充

· 技术原理：LAMP技术是一种等温扩增方法，通过特定的引物设计，在恒温条件下实现对目标DNA的快速扩增。而Pf Ago则是一种来源于古菌的核酸内切酶，能够识别并切割特定的DNA序列。在本研究中，LAMP扩增的产物被用作Pf Ago的底物，通过荧光信号的变化来检测L. monocytogenes的存在。

· 实验设计：为了验证LAMP-PfAgo系统的性能，研究者设计了多个实验。首先，他们提取了食品样品中的DNA，并使用LAMP-PfAgo荧光检测法进行检测。然后，他们使用LFS法对同一批样品进行检测，以验证结果的准确性。此外，研究者还使用qPCR作为对照方法，进一步验证了LAMP-PfAgo系统的可靠性。

· 数据分析：研究者通过统计软件对实验结果进行了详细分析。他们计算了不同检测方法之间的匹配率，并比较了它们的特异性和敏感性。此外，研究者还通过图表形式直观地展示了实验结果，使读者更容易理解研究的结论。

· 技术优势：与现有的检测方法相比，LAMP-PfAgo系统具有多个优势。首先，它的操作过程相对简单，不需要复杂的仪器设备和专业的操作人员。其次，由于LAMP技术的等温扩增特性，它可以在较短的时间内实现对目标DNA的大量扩增，从而提高了检测的灵敏度。最后，Pf Ago的单碱基分辨率使得LAMP-PfAgo系统具有高度的特异性，能够准确地区分L. monocytogenes和其他病原体。

· 应用前景：随着食品安全意识的提高和临床检测需求的增加，LAMP-PfAgo系统有望成为一种重要的检测工具。它不仅可以用于食品样品的快速筛查和监测，还可以用于临床样品的检测和分析。此外，研究者还可以进一步探索LAMP-PfAgo系统在环境监测、生物安全等领域的应用潜力。

图1所示。基于LAMP-PfAgo的单核增生乳杆菌检测工作流程(A) LAMP-PfAgo法检测单核增生乳杆菌核酸可视化的具体过程。(B) gDNA引导下PfAgo“双步”裂解示意图。(C)基因组提取或快速样品裂解后进行分析所需的最小设备包括可移动电源、加热块、移液器和吸管

图2所示。LAMP的筛选与优化。(A) LAMP引物筛选。(B) LAMP反应内外引物浓度比优化。(C) LAMP反应温度的优化。(D) LAMP反应时间优化。(E) LAMP反应Mg2+浓度优化。

图3所示。gDNA筛选。(A)在20% TBE-PAGE凝胶上分析了4个gDNA引导的PfAgo裂解的ssdna。(B)分别在0、1、2和3个gDNA引导下LAMP -PfAgo反应的荧光强度。

图4所示。LAMP-PfAgo反应最佳浓度的优化。(A) LAMP-PfAgo反应Mn²⁺浓度优化。(B) LAMP-PfAgo反应gDNA浓度优化。(C) LAMP反应PfAgo浓度优化。

图5所示。LAMP-PfAgo检测单核细胞增生乳杆菌的特异性。(A)终点荧光强度读数，验证LAMP-PfAgo荧光法的特异性。(B)紫外和蓝光下目视观察LAMP-PfAgo荧光法的特异性。(C)目视检查以验证LAMP-PfAgo -LFS测定的特异性。NTC: RNase-free ddH2O阴性对照。误差柱为平均值±SEM；n = 3, ****P < 0.0001。（读者可参阅本文的网页版本，以了解该图例中有关颜色的解释。）

图6所示。LAMP-PfAgo检测单核细胞增生乳杆菌的灵敏度。(A) LAMP-PfAgo灵敏度的终点荧光强度读数；(B)紫外和蓝光下目视观察LAMP-PfAgo荧光法的灵敏度。(C) LAMP-PfAgo -LFS检测灵敏度的目视检查。NTC: RNase-free ddH2O阴性对照。误差柱为平均值±SEM；n = 3, ****P < 0.0001。（读者可参阅本文的网页版本，以了解该图例中有关颜色的解释。）

图7所示。采用qPCR、LAMP-PfAgo荧光和LAMP-PfAgo- lfs法验证食品来源样品。(A) LAMP-PfAgo荧光法结果，包括显示归一化平均荧光值的荧光热图，以及紫外和蓝光下的观察结果。(B)样品结果的qPCR方法。(C) LAMP-PfAgo-LFS法测定样品结果。轨道1−18：样本数。（读者可参阅本文的网页版本，以了解该图例中有关颜色的解释。）