具有协同扩增效应的三维膜状纳米酶用于呼吸道病毒的超灵敏免疫层析检测

1、引言

现有的横向流动免疫层析检测(LFAs)技术虽然具有操作简便、成本低廉等优点,但其检测灵敏度较低,难以满足早期病原体检测等要求。一种有效提升LFAs灵敏度的方法是使用具有强大催化活性的纳米酶作为报告探针,通过酶促放大信号来增强检测灵敏度。然而,传统球形纳米酶存在催化位点少、稳定性差等缺点。

本文作者设计了一种三维(3D)膜状纳米酶(GO-Pt₃₀-AuPt₅),通过将石墨烯氧化物(GO)纳米膜为基底,有序组装一层纳米铂纳米颗粒(Pt NPs)和一层纳米金@铂卫星颗粒(Au@Pt NPs),大幅提升了酶促催化活性和检测灵敏度。

2、结果与讨论

2.1 三维膜状纳米酶的构建与表征

采用聚乙烯亚胺(PEI)辅助,将30 nm的铂纳米粒子(Pt₃₀)和5 nm的Au@Pt卫星粒子有序组装在石墨烯氧化物(GO)纳米膜上,形成了具有3D柔性纳米结构的GO-Pt₃₀-AuPt₅膜状纳米酶。

GO提供了大面积反应界面和稳定性,Pt₃₀赋予了强大的着色和催化活性,而Au@Pt卫星进一步提升了催化性能和靶向捕获能力,三者协同增强了纳米酶的催化和信号放大能力。

通过TEM、EDS、XPS等表征手段,深入分析了该3D膜状纳米酶的结构特征和组成。

2.2 膜状纳米酶的催化性能评估

与单一纳米颗粒相比,GO-Pt₃₀-AuPt₅膜状纳米酶在催化氧化TMB染色剂产生蓝色信号时表现出更强的着色和催化活性。

系统对比了不同尺寸纳米粒子组装的2D和3D膜状纳米酶,发现3D结构可以提供更多催化位点和靶向结合位点,进一步放大了信号响应。

理论计算分析表明,3D膜状结构可以增强近场电磁场,进而提高催化效率。

2.3 基于膜状纳米酶的超灵敏LFA检测

将GO-Pt₃₀-AuPt₅纳米酶应用于LFA系统,通过在测试线上进行催化底物的酶沉积放大,实现了对SARS-CoV-2和H1N1病毒的超灵敏检测。

该LFA法的检出限达到1 pg/mL水平,相比于传统ELISA和AuNP-LFA分别提高了20倍和1900倍。

使用49份临床呼吸道样本进行验证,结果证实该LFA方法在临床应用中具有较高的灵敏度和特异性。

3、结论

通过PEI介导的静电自组装，在二维氧化石墨烯纳米膜上连续涂覆一层大Pt NPs （30 nm）和一层小Au@Pt卫星（5 nm），成功制备了三维膜状纳米酶GOPt₃₀-AuPt₅，并阐述了其作为比色/催化双增强纳米膜在LFA中的应用，用于快速检测SARSCoV-2和H1N1。3D GOPt₃₀-AuPt₅纳米膜结合了2D单层氧化石墨烯片（优异的导电性、高稳定性和大表面积）、数百个30 nm的氧化石墨烯纳米粒子（强比色和过氧化物酶样活性）和数千个5 nm的Au@Pt卫星（众多活性催化位点）的独特优势，从而产生了三倍的底物催化信号放大，大大提高了当前LFA系统的灵敏度和检测范围。提出的纳米酶- LFA系统在20 min内实现了对SARS-CoV-2和H1N1的直接和超灵敏监测，LOD分别低至0.0013和0.00084 ng/mL，比未增强时的LOD低约100倍。此外，GOPt₃₀-AuPt₅- LFA的灵敏度比传统的基于AuNP的LFA试纸和ELISA分别高出至少1900倍和20倍。这项工作是第一次将2D和3D膜状纳米酶引入LFA技术，并展示了它们优越的检测能力。此外，通过检测25例SARS - CoV-2阳性标本和24例H1N1阳性标本，验证了所提出的检测方法在临床应用中的可靠性，发现GOPt₃₀-AuPt₅−LFA的结果与ELISA和qRT-PCR的结果一致。此外，纳米酶- LFA系统的测试时间缩短到18分钟。理论上讲，基于GOPt₃₀-AuPt₅的纳米酶- LFA系统可以作为其他病原病毒、细菌和癌症生物标志物的通用测试平台，只需改变膜状纳米酶和试纸上的特异性捕获/检测抗体。GOPt₃₀-AuPt₅- LFA具有操作简单、直观观察、灵敏度高的优点，可作为一种功能强大、用户友好的POCT技术，用于疾病监测，特别适用于资源匮乏地区。

参考文献

Wang, C., Shen, W., Li, Z., Xia, X., Li, J., Xu, C., Zheng, S., & Gu, B. (2024). 3D Film-Like Nanozyme with a Synergistic Amplification Effect for the Ultrasensitive Immunochromatographic Detection of Respiratory Viruses. ACS Nano, 18(37), 25865-25879.