推进COVID-19诊断:利用30纳米金纳米颗粒内化纳米凹陷底物增强SERS-PCR

实时荧光PCR(RT-PCR)是目前诊断新冠肺炎的金标准方法,但其检测灵敏度受限,需要多轮扩增才能检测出低浓度病毒核酸,大大延长了检测时间,不利于现场快速诊断。为克服这一局限性,研究人员开发了基于表面增强拉曼散射(SERS)的无核酸扩增的新型检测平台。SERS技术利用金属纳米结构的局域表面等离子体共振(LSPR)效应,可以大幅放大目标分子的拉曼散射信号,从而提高检测灵敏度。

在此前的研究中,作者构建了一种基于DNA杂交的混合纳米等离子体SERS-PCR平台,通过在纳米凹穴基底(AuNDS)内均匀固定单个80 nm金纳米粒子(AuNP),获得了8×10⁷倍的SERS增强因子和稳定的SERS信号。本研究进一步探索在AuNDS凹穴内固定多个小尺寸AuNP,以期产生更强的LSPR增强,提高SERS-PCR的检测灵敏度。

AuNDS凹穴的弧形表面可使折射/反射光在等离子腔内传播更远,形成热点。当AuNP内化至凹穴内时,AuNP与腔表面之间的等离子体耦合效应会导致电磁场强度大幅提升。与单个AuNP相比,在狭小的AuNDS凹穴内固定多个AuNP,不仅可增强AuNP与腔表面的耦合,还可产生AuNP之间的强耦合,形成更多的热点区域,从而进一步提高LSPR增强效果。

本研究通过DNA杂交在AuNDS凹穴内固定不同尺寸(70、55和30 nm)的AuNP,结合有限差分时域(FDTD)模拟分析电场分布,并评估了SERS-PCR检测灵敏度。目的是通过控制AuNP尺寸和数量,在AuNDS凹穴内形成多个纳米间隙热点,实现强LSPR增强,从而开发出无需扩增的高灵敏SERS-PCR诊断方法。

1、AuNP内化至AuNDS凹穴的机制

首先,将捕获DNA固定在AuNDS凹穴表面,为后续AuNP的内化提供模板。然后利用种子生长法制备出70、55和30 nm三种尺寸的AuNP,并在其表面共价连接Raman报告分子和检测DNA。将检测DNA-AuNP溶液滴加到AuNDS表面,在37°C高湿环境中孵育45 min后,经超声洗涤可在AuNDS凹穴内均匀分散不同尺寸的AuNP。SEM图像验证了这一结果。

2、不同尺寸AuNP内化AuNDS的FDTD模拟

我们利用FDTD模拟技术,分析了3种不同尺寸AuNP(70、55和30 nm)内化AuNDS时电场分布的变化。结果表明,当30 nmAuNP(平均19个)内化时,电场强度分布最广,最大电场增强因子达到43.06,远高于70 nmAuNP(1个,8.69)和55 nm AuNP(3个,33.17)。这是因为,尽管小尺寸AuNP的AuNDS-AuNP耦合效应较弱,但当多个AuNP内化至狭小的凹穴时,AuNP之间以及AuNP-基底之间的强烈耦合效应,导致电场分布更广且更强。

3、不同尺寸AuNP内化AuNDS的SERS增强效果

比较了3种不同尺寸AuNP内化AuNDS的SERS增强效果。结果显示,30纳米AuNP体系的SERS信号强度明显高于70和55 nm AuNP,SERS成像也更亮且分布更均匀。计算得到的SERS增强因子分别为8.02×10⁷、1.55×10⁸和2.41×10⁸,随着AuNP尺寸的减小,SERS增强效果逐步提高。这再次证实,在AuNDS凹穴内固定多个小尺寸AuNP可产生更强的LSPR增强。

4、利用不同尺寸AuNP内化AuNDS的RdRp桥接DNA定量分析

进一步评估了3种AuNP体系在检测新冠病毒RdRp基因方面的性能。结果表明,30纳米AuNP检测RdRp DNA的检测限约为10-4 nM,较70和55纳米AuNP分别提高约10和3倍。这得益于30纳米AuNP内化后产生更多热点区域,LSPR增强更强。值得一提的是,在30纳米AuNP-AuNDS SERS-PCR平台上,仅需6个PCR循环即可检测出低浓度RdRp基因,大大优于传统RT-PCR需要25个循环。

结论：本研究通过在AuNDS凹穴内固定多个小尺寸AuNP,构建出一种具有强LSPR增强效果的SERS-PCR诊断平台。与传统RT-PCR相比,该平台可在仅6个循环内检测出低浓度RdRp基因,为实现无扩增的高灵敏分子诊断奠定了基础。未来我们将进一步优化AuNP尺寸和数量,力争进一步提高SERS-PCR的检测灵敏度和重现性,期望开发出更加实用的新冠肺炎快速诊断技术。

参考文献

Dang, H., Joung, Y., Yang, J.-Y., Lee, S. H., Lee, S., Joo, S.-W., . . . Choo, J. (2024). Advancing COVID-19 Diagnosis: Enhancement in SERS-PCR with 30-nm Au Nanoparticle-Internalized Nanodimpled Substrates. Small, n/a(n/a), 2403672. https://doi.org/10.1002/smll.202403672.