用于呼吸道细菌超灵敏多重免疫层析检测的二维氧化石墨烯荧光纳米探针的合成

细菌性下呼吸道感染（LRIs）是由多种呼吸道细菌引起的，包括肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌等，给人类健康带来了严重威胁，每年导致至少300万人的死亡。然而，呼吸道细菌感染的临床症状（如咳嗽、呼吸困难和发热）与许多病毒引起的呼吸道疾病（如流感病毒和SARS-CoV-2）相似，这使得早期诊断和治疗面临挑战。传统的细菌鉴定方法是微生物平板培养，通常需要24-72 h，且灵敏度不足，无法及时指导治疗。虽然多种分子检测技术（如PCR和质谱法）已被开发用于准确诊断，但这些技术通常需要昂贵的设备和专业人员，不适合资源有限的环境。因此，迫切需要一种简便、高灵敏度且快速的呼吸道细菌诊断工具。免疫层析法（ICA）作为一种快速、低成本的即时检测方法，在食品安全和健康监测中得到了广泛应用。然而，目前ICA对细菌的灵敏度仍较低，且在复杂生物样本中难以实现多重检测。因此，需要开发具有高流动性、优异稳定性和强量化信号的新型光学纳米探针，以满足临床需求。氧化石墨烯因其良好的分散性和电子特性，成为构建生物传感器的理想材料，但尚未在ICA中得到充分应用。

基于此，德克萨斯大学奥斯汀分校研究者提出了一种二维氧化石墨烯荧光纳米探针的多重免疫层析检测，用于对呼吸道细菌的超灵敏检测。方案1展示了免疫氧化石墨烯量子点纳米片的制备及其在免疫层析（ICA）条带中的应用。通过阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）介导的静电吸附，CdSe@ZnS量子点在二维氧化石墨烯薄片上自组装形成纳米片结构（方案1a）。该过程将带负电荷的氧化石墨烯与带正电荷的量子点结合，形成一种结合了氧化石墨烯优良分散性和量子点卓越荧光特性的高性能荧光纳米探针，适用于ICA检测。如图1b所示，将偶联抗体的GO-QD纳米片与细菌样品混合后，滴加于ICA样品垫上。形成的GO-QD/细菌复合物在毛细管作用下沿条带迁移，并被T线上预包被的单克隆抗体捕获。荧光强度与金黄色葡萄球菌/S浓度成正比，从而实现对肺炎菌的定量检测。对照组通过加载抗兔IgG和抗小鼠IgG的混合物，确保捕获多余的免疫GO-QD，以进行质量控制。通过读取两条T线的荧光强度，能够灵敏地定量检测两种目标细菌。

方案1 (a)二维免疫氧化石墨烯qd纳米片的制备；(b)同时超灵敏检测两种呼吸道细菌的氧化石墨烯qd ICA原理。

研究人员系统地表征了氧化石墨烯量子点（GOQD）纳米片的形貌、光效和化学性质。透射电子显微镜（TEM）图像显示，裸露的氧化石墨烯薄片呈半透明的二维膜结构，具有良好的分散性（图1a）。以往研究表明，阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）能够快速自组装到带负电荷的材料表面，如Fe3O4、AuNPs和SiO2纳米球，并使其带电正性。PEI修饰后的GOPEI的zeta电位从−36.0 mV增加到33.7 mV，证实了PEI成功涂覆在GO表面（图2a）。高分辨率TEM（HRTEM）图像显示，PEI涂层不会影响GO薄片的柔性结构。GO-PEI片材具有强正电荷和巨大的二维表面积，便于吸附带负电荷的量子点。通过延长反应时间，可有效控制吸附在氧化石墨烯薄片上的量子点密度（图1b-d）。HRTEM图像显示，氧化石墨烯表面覆盖了一层致密的CdSe@ZnS量子点，单个量子点直径约为15 nm（图1e），并且吸附的量子点晶格间距为0.349 nm，这与CdSe的立方结构相符（图1f）。

图1 合成氧化石墨烯qd纳米片的结构表征。(b) 20 min, (c) 40 min, (d) 60 min不同超声周期合成的(a)氧化石墨烯和(b)氧化石墨烯qd纳米片的TEM图像。(e)氧化石墨烯-量子点纳米片和(f)吸附CdSe@ZnS量子点的放大TEM图像。(g)氧化石墨烯qd纳米片的EDS能谱图和(h)氧化石墨烯qd纳米片的EDS元素（Cd, Se, Zn， S）图谱。图1g中的强Cu信号来源于TEM铜栅格。

研究人员表征了氧化石墨烯量子点（GOQD）纳米片的zeta电位，发现随着量子点（QD）层覆盖面积的增加，其zeta电位逐渐降低，并在60 min超声处理后稳定在6.3 mV（图2a），表明60 min的反应时间足以实现QD的完全吸附。能量色散X射线能谱（EDS）分析结果显示，制备的GO-QD纳米片主要成分包括C、O、Cd、Se、S和Zn（图1g）。EDS图谱清晰显示了Cd（红色）、Se（绿色）、Zn（蓝色）和S（黄色）在GO薄片外的分布，证实了GO-QD纳米片的成功合成。

此外，研究评估了氧化石墨烯-量子点纳米片的荧光特性。不同量子点量的GO-PEI和GO-QD纳米片在紫外光下显示出不同的荧光强度，氧化石墨烯-量子点纳米片随着量子点数量的增加而增强其发光能力。经过365 nm紫外光激发，GO-QD纳米片在631 nm处表现出稳定的主发射峰，适用于荧光分析。研究还评估了其在复杂溶液中的光学和胶体稳定性，结果显示GOQD纳米片在高盐样品和不同pH值下保持稳定的荧光强度。动态光散射（DLS）结果表明，GO、GO-PEI和GO-QD的水动力尺寸均约为500 nm，说明PEI层和QD小尺寸对GO薄片的分散性影响不大。这些优越特性使得氧化石墨烯-量子点纳米片成为高性能ICA纳米探针的理想选择。

图2 二维氧化石墨烯qd纳米片的性质表征。(a)氧化石墨烯、氧化石墨烯- pei和三种不同QD数的氧化石墨烯-QD纳米片的Zeta电位，(b)照片和(c)荧光发射光谱。(d)不同盐浓度（10 mM - 1000 mM NaCl）下GO-QD纳米片的荧光稳定性。(e)不同pH值的PBS溶液中GO-QD纳米片的照片（上）及其在最大发射波长下对应的荧光强度（下）。(f)氧化石墨烯、氧化石墨烯pei和氧化石墨烯qd纳米片的DLS分布。

由于表面形成了大量羧基化的量子点，GOQD纳米片为抗体结合提供了广阔的表面积和丰富的表面羧基。如方案1a所示，金黄色葡萄球菌和肺炎球菌的单克隆抗体通过碳二亚胺交联固定在GO-QD表面。研究人员利用过量的抗体制备免疫氧化石墨烯-量子点纳米片，并通过不同载药量（5~20 μg）的抗菌抗体修饰，验证了GOQD纳米片表面抗体的最大负载能力。与15 μg抗体偶联后，免疫GO-QD的zeta电位稳定在-21.5和-17.3 mV，表明GOQD表面的抗体数量达到饱和。透射电子显微镜（TEM）研究显示，免疫GO-QD纳米片能够在10秒内快速有效地与目标呼吸道细菌结合（图3d）。扫描电子显微镜（SEM）分析进一步揭示了细菌-GO-QD复合物的表面形态。结果显示，在没有靶菌的溶液中，免疫GO-QD纳米片呈现典型的片状结构，而在金黄色葡萄球菌和肺炎球菌存在时则紧密粘附于其表面（图3g和3i）。这些结果表明，与裸细菌细胞相比，形成的细菌-GO-QD复合物并未显著增加大小，有助于免疫复合物沿ICA条带的运输。这一发现突显了氧化石墨烯-量子点纳米片作为膜状免疫探针在细菌检测中的优势。

图3 (a)金黄色葡萄球菌的TEM图像，(b) GO-QD-S的免疫复合物。(c)肺炎链球菌和(d) GO-QD-S的免疫复合物。肺炎。(e) GO-QD纳米片，(f)金黄色葡萄球菌，(g) GO-QD- s。(h)肺炎链球菌和(i) GO-QD-S。

研究人员利用氧化石墨烯量子点（GOQD）纳米片的单分散性和柔性结构，构建了一个多重免疫层析（ICA）平台，以同时诊断两种呼吸道细菌。通过在NC膜上设置两条平行的T线（T1和T2），分别喷洒金黄色葡萄球菌和肺炎球菌的捕获抗体，形成金黄色葡萄球菌检测T1系和肺炎球菌检测T2系。研究首先评估了抗体在这两种T细胞系上的亲和力和特异性，使用含有10⁵ cfu/mL的样品进行测试。结果显示，含有两种目标菌的样品在GO-QD-ICA条带上呈现出两条明亮的荧光T线，而单独含有任一种细菌的样品则仅显示一条荧光T线，且未出现假阳性信号，表明抗体之间没有交叉反应。

利用商用荧光条带读取器，研究人员能够同时测量ICA条带上两条T线的荧光强度，为快速定量检测奠定基础。为了获得最高灵敏度，对修饰在T区的捕获抗体浓度进行了优化。最终选择了1 mg/mL的金黄色葡萄球菌抗体和2 mg/mL的肺炎球菌抗体进行修饰。此外，研究还探讨了不同运行缓冲液对ICA性能的影响，发现使用PBST-F缓冲液能有效抑制GO-QD在T细胞系上的非特异性吸附，最大化信噪比。最后，反应时间被优化为20 min，以适应该方法的要求。

图4 (a)照片和(b)不同浓度金黄色葡萄球菌和肺炎葡萄球菌下基于go - qd的ICA对应的荧光强度（T线）：(i) 10⁵、10⁵ cfu/mL；（ii） 10⁵,0 cfu/mL；（iii） 0,10⁵ cfu/mL；（iv） 0,0 cfu/mL。（c,d）检测(c)金黄色葡萄球菌（S. aureus）和(d)肺炎葡萄球菌（S. pneumoniae）时两条T线上捕获抗体浓度的优化。（e-f）基于go - qd的ICA试纸运行缓冲液优化：(e)测试试纸的照片，(f)不同运行缓冲液溶液下T线对应的荧光强度。误差条表示从三个独立测试中计算出的标准偏差。

在优化条件下，研究人员系统验证了氧化石墨烯量子点（GOQD）纳米片在超灵敏定量检测呼吸道细菌方面的性能。通过梯度稀释法制备不同浓度（10⁶-0 cfu/mL）的肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌样品，并采用该方法进行检测。图5a显示了同时检测两种细菌的测试条的荧光图像，结果表明，随着金黄色葡萄球菌浓度的增加，两条T线上的红色荧光信号变得更加明亮。肺炎链球菌的检测范围为10²至10⁵ cfu/mL。当金黄色葡萄球菌和肺炎球菌浓度超过10⁶ cfu/mL时，T1和T2系均出现钩效应，导致T区的荧光强度被过量靶菌抑制。在100 cfu/mL的条件下，两种目标菌的可见荧光T线可通过肉眼区分。

为了实现荧光定量，研究人员读取了T1和T2细胞系的荧光强度，并绘制了金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌浓度对数的函数图（图5b-c）。两种T细胞系的荧光信号在20 ~ 10⁵ cfu/mL范围内具有较宽的动态范围，相关系数（R²）分别为0.994和0.982。GO-QD-ICA试纸条在20 ~ 500 cfu/mL的线性范围内表现出良好的线性相关性，金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的R²分别为0.991和0.982。根据标定曲线，GO-QD-ICA对肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌的检测限（LOD）分别为13和20 cfu/mL。平板培养法用于测定样品浓度，与GO-QD-ICA结果一致，表明该方法具有良好的准确性。作为潜在的POCT工具，GO-QD-ICA的检测性能与基于AuNP和商用QD纳米粒子的ICA进行了比较，发现GO-QD-ICA对呼吸道细菌的检测灵敏度分别比传统方法高约500倍和100倍。这一显著提高归因于GO-QD纳米片优越的性能，包括巨大的QD负载能力、出色的色谱分散性及其柔性膜结构，有助于细菌的紧密结合。

图5 (a)基于go - qd的ICA同时检测金黄色葡萄球菌（T1）和肺炎葡萄球菌（T2）的荧光图像。（b,c） T线荧光强度与(b)金黄色葡萄球菌和(c)肺炎葡萄球菌浓度的关系。(d)基于aunp的ICA试纸条检测不同浓度肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌的照片。（e-f）定量测定(e)肺炎链球菌和(f)金黄色葡萄球菌的标准平板计数方法。(g)基于qb的商用ICA检测肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌的荧光图像。（h-i）基于qb的ICA检测(h)肺炎链球菌和(i)金黄色葡萄球菌的相应检测株强度。(h)中插入的是商用QB粒子的TEM图像。

考虑到呼吸道病原体主要通过喉咙和鼻腔分泌物传播，研究人员特别关注基于GO-QD的免疫层析（ICA）方法在真实样本分析中的可靠性与准确性。他们使用人痰样本验证了GO-QD-ICA方法的特异性和稳定性。实验中，将高浓度（10⁷ cfu/mL）的四种高传染性呼吸道病毒（如流感A H1N1、流感B、呼吸道合胞病毒和SARS-CoV-2伪病毒）以及10⁶ cfu/mL的表皮葡萄球菌加入痰液样品中，以检验该方法的特异性。结果显示，所有非目标病原体在T区的荧光信号均可忽略不计，而阳性组中含有金黄色葡萄球菌和肺炎球菌的样品在对应T线上产生了强烈的荧光信号，表明该方法对目标细菌具有良好的特异性。

此外，GO-QD-ICA在复杂生物样品中的稳定性也得到了评估，结果显示相对标准偏差（RSD）小于4.2%，表明其具有较高的重复性和稳定性。为了进一步验证该方法在实际样品中的准确性，研究人员将不同浓度的金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌（1 × 10⁵、1 × 10³、1 × 10² cfu/mL）加入人痰标本中，并与传统检测方法（如PCR和基于AuNP及商用QD的ICA）进行比较。PCR分析结果显示，细菌浓度越高，电泳带越亮，且GO-QD-ICA结果与PCR分析一致，表明该方法在实际样品中具有良好的检测性能。

进一步计算回收率时，金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的平均回收率分别为90.7%至97.0%和89.9%至109.0%，低RSD值为3.09%至6.52%。GO-QD-ICA条带对相同细菌感染痰样本的灵敏度显著高于基于AuNP和商用QD的ICA。研究结果表明，GO-QD-ICA方法在临床样品中对呼吸道细菌的定量检测具有良好的适用性和准确性。此外，该方法具备高灵敏度、良好稳定性、快速分析、操作简便及低成本等优点，相较于其他基于ICA的细菌检测策略，GO-QD-ICA展现出更高的灵敏度和多重检测能力。其优异性能归因于先进的膜状免疫探针及其优良的荧光强度、灵活的纳米结构等特性。通过修饰不同识别分子，该方法还可扩展到其他病原微生物的敏感定量分析，为传统免疫分析方法提供了更强大的替代方案。

图6 GO-QD-ICA、PCR、基于aunp的ICA和基于商用qb的ICA对痰液中金黄色葡萄球菌和肺炎葡萄球菌检测性能的比较(a) PCR分析、(b) GO-QD-ICA法、(c)基于aunp的ICA法、(d)基于商用qb的ICA法对目标菌痰样的检测结果。(e)所测qb基ICA条对应的测试线强度。(f) GO-QD-ICA法检测痰液样品中两种呼吸道细菌的回收率结果

本研究设计了一种新型的基于氧化石墨烯的二维量子点纳米片，并将其引入到免疫层析（ICA）系统中，作为高稳定性的荧光纳米探针用于呼吸道细菌的检测。通过聚乙烯亚胺（PEI）介导的静电吸附，大量CdSe@ZnS-MPA量子点被吸附在氧化石墨烯纳米片的两侧，从而制备了氧化石墨烯量子点纳米片。该膜状免疫探针由三个功能域组成：第一，200-500 nm的氧化石墨烯作为柔性亲水性载体；第二，双面量子点壳体包含数百个量子点，以产生优越的发光；第三，表面修饰的抗细菌抗体可有效粘附于目标细菌。这项研究首次报道了GO-QD纳米片作为超灵敏荧光探针的制备，并实现了通过ICA生物传感器同时检测两种呼吸道细菌。未来，该方法有望成为快速准确检测细菌的强大诊断工具

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2021.131836