基于荧光免疫纳米纤维的细菌感染剂（无乳链球菌）的快速荧光筛选测定和双重电化学传感

在Covid-19改变人类生活和人际交往的背景下，快速检测和识别感染源及病毒变得至关重要。传统的诊断方法如培养、生化试验和毒力试验反应时间较长（超过24小时），而血清学方法如ELISA和试纸条在使用多克隆抗体时准确性和敏感性较低。因此，开发一种便携式探针以快速显示样品是否被感染并确定感染剂量显得尤为必要。结合荧光与电化学系统的优势一直是科学研究的重点，其中电化学发光（ECL）作为一种强大的生物传感工具，由于其高灵敏度、低背景信号及宽动态范围而受到关注。尽管已有一些研究利用量子点进行电化学发光与光电化学免疫检测，但内部成分的自荧光活性仍是主要挑战。因此，本研究探讨了量子点与细菌之间的光电子相互作用，为未来的应用提供了新思路。

基于此，塔比亚特莫德雷斯大学研究者提出了一种基于荧光免疫纳米纤维的双荧光-电化学传感器，用于检测新生儿肺炎和脑膜炎的病原体无乳链球菌。图1显示了基于荧光免疫纳米纤维的荧光电化学传感器的原理图。在本研究中，将QD混合物在PAN溶液中静电纺丝，在金电极表面制备荧光纳米纤维。一层一层地修饰荧光纳米纤维的表面，以暴露作为固定抗无乳链球菌特异性抗体的底物的官能团。细菌附着在荧光免疫纳米纤维表面是可检测的两种替代方法，微观荧光观察和电化学阻抗谱。生物传感器的光学和电化学灵敏度取决于嵌入纳米纤维的量子点的数量分别为信噪比。有趣的是，在这种情况下，似乎需要通过金-量子点-聚合物链的连续电子-电荷转移系统来提供荧光和电化学活性。因此，对影响免疫荧光纳米纤维荧光和电化学活性的静电纺丝条件、量子点浓度和化学处理等参数进行了优化。

图1 电化学荧光免疫传感器制作工艺示意图。

在静电纺纳米纤维的显微分析中，研究人员利用场发射扫描电子显微镜（FESEM）观察纳米纤维的形态，以优化静电纺丝参数。结果显示，当聚丙烯腈（PAN）浓度低于13%时，纳米纤维呈颗粒状结构；而在13%浓度时，纳米纤维的尺寸均匀且无珠状结构。因此，确定最佳电纺丝条件为PAN浓度13%、进料速率1.0 mL/h、电压17.5 KV以及针尖与集热器之间距离15 cm，此条件下可获得直径约为250 nm的纳米纤维。为制备荧光纳米纤维，研究者采用含有13% w/v PAN和1% w/w量子点（QD）的溶液进行静电纺丝。该聚合物在紫外光激发下显示出均匀的红色荧光，表明量子点在溶液中分散良好。

图2 静电纺丝纳米纤维在12% (A)和13% (B) w/v PAN/DMF溶液中的FESEM图像。13%聚丙烯腈聚合物溶液加和不加1% QD时的荧光发射(C)。荧光静电纺纳米纤维的FESEM (D)、荧光(F)和亮场(G)图像。

在荧光纳米纤维的表面改性过程中，研究者首先通过静电纺丝在金电极表面制备了聚丙烯腈（PAN）纳米纤维，并将其表面的氰化物官能团转化为活化羧基，采用NaOH和NHSEDC两步处理。红外光谱分析显示，未经处理的PAN纳米纤维在2930、2241和1736 cm⁻¹处有特征峰，这些峰分别对应于C-H、C≡N和C=O基团的拉伸振动。处理后的荧光纳米纤维光谱证实量子点成功嵌入纳米纤维中，而非简单附着于表面，表明其荧光性能在后续改性中可保持稳定。此外，NaOH处理导致部分PAN转化为聚丙烯酸（PAA），降低了纳米纤维的密度并提高了其溶解度。FT-IR光谱进一步确认了羧基的形成，显示2241 cm⁻¹处峰强度下降，同时在2500-3800 cm⁻¹范围内出现宽峰，归因于羧基的存在。

图3 (A)带QDs和不带QDs以及NaOH处理5和30 min后PAN纳米纤维的FT-IR光谱(B)荧光纳米纤维的XRD谱图

荧光检测技术是快速识别和鉴定微生物（如细菌和病毒）最重要的方法之一。微生物具有与细胞内荧光团（例如胶原蛋白、黄素和一些代谢物）相关的固有荧光特性，导致其光学行为在化学结合和距离小于10 nm的情况下发生变化。为确保底物的化学功能化成功，研究者在荧光纳米纤维表面固定了一种针对无乳链球菌的特异性抗体，并通过荧光强度评估其对无乳链球菌的选择性。功能化后的荧光纳米纤维在显微镜下显示，与对照组相比，s. agalactiae与纳米纤维结合并产生暗点，从而抑制了荧光发射，而金黄色葡萄球菌则被洗脱，显示出无显著差异。这表明抗体的沉积赋予了纳米生物传感器特异性的诊断能力。此外，经过目标菌杂交鉴定后，荧光强度与细菌浓度呈正相关，随着浓度增加至10⁶ CFU/mL时，荧光强度显著降低，表明量子点被完全淬灭。

图4 (A)功能化荧光纳米纤维（CTRL）与无乳链球菌和金黄色葡萄球菌处理的荧光显微镜图像。(B)经不同浓度无乳乳酸处理的功能化荧光纳米纤维的荧光显微镜图像，高倍放大镜下的亮场视图。(C)在200 ~ 800 nm范围内PAN吸光度光谱与QD发射光谱对比。(D)相同波长范围内S. agalactiae激发和荧光发射光谱(E) 540 ~ 700 nm范围内QDs发射和S. agalactiae激发光谱重叠，通过FRET机制诱导QDs猝灭。

荧光团作为能量供体和受体之间的能量转移机制主要依赖于近距离（<10 nm）振荡偶极子之间的电荷-电荷相互作用。研究表明，将纳米颗粒嵌入聚丙烯腈（PAN）静电纺丝纤维中，能够有效提高纳米纤维的结晶程度，进而改善其微观结构秩序和电荷密度。在这种情况下，荧光纳米纤维的纤维结构表现出更好的取向性。此外，纳米纤维内的量子点与表面的抗体之间的化学结合加速了能量转移过程。由于细菌的空间障碍，细菌附着后，电子-电荷转移系统的有效性更多依赖于纳米纤维与抗体之间化学键的质量，而非数量。因此，有限数量的抗体在细菌附着后参与了FRET过程。通过EIS研究，逐层修饰后的金电极表现出较高的电阻，验证了表面修饰的成功。尽管聚合物具有高电子密度，但PAN/QD涂层仍保持了导电性。实验结果显示，细菌结合后，荧光纳米纤维发射光子的能力受到影响，从而导致电子转移过程中的非均质性增加。这些发现为理解生物传感器在细菌检测中的性能提供了重要依据。

图5 A)包含量子点的荧光纳米纤维的纤维结构。B)在频率为0.01 Hz ~ 100 kHz的Fe(CN)63-/4- 0.10 M溶液中，分别涂覆PAN/QD、NaOH处理和Antibody沉积前后的Nyquist曲线。1) pan与QDs分子轨道重叠导致的电极非均质性机制；2)电化学测量过程中，有无细菌结合、发射和猝灭途径（路径虚线1和2）时电极表面的光电子相互作用；3)不同纳米纤维间的传导；等效电路模型（ECM）。

在阻抗传感器的应用中，当电路的等效电阻和电容涉及复杂参数时，测量阻抗作为频率的函数，以确定其与分析物浓度的关系。研究者利用EIS法测定无乳链球菌（S. agalactiae）的浓度，通过抗体吸附的特异性亲和力进行检测。细菌的毒力和致病性可以通过计算引起活动性感染或杀死50%受感染动物所需的病原体细胞数（ID50或LD50）来量化，通常范围在10到10⁶ CFU/mL之间。实验结果显示，随着细菌浓度从10 CFU/mL增加到10⁶ CFU/mL，电极的阻抗测量记录了明显变化，奈奎斯特曲线表明电荷传递阻力随细菌浓度增加而增大。为表征修饰后的电极行为，使用等效电路解释EIS数据，构建的等效电路包括溶液串联电阻、氧化还原反应的电荷转移电阻、恒相元和Warburg元件。研究发现，在10-10⁶ CFU/mL范围内，细菌浓度与电子传递电阻之间呈现良好的线性关系，相关系数达到0.9763，检出限为6 CFU/mL。这表明所制备的电极不仅适用于初始荧光检测，还可用于在线定量细菌浓度。

图6 A)细菌浓度从10 CFU/mL到10⁶ CFU/mL时荧光免疫电极的Nyquist曲线。B)相关等效电路。C)细菌测定的校准曲线。

本研究成功开发了一种基于荧光免疫纳米纤维的双模式传感器，用于检测新生儿肺炎和脑膜炎的病原体无乳链球菌（S. agalactiae）。该细菌不仅在新生儿中引起严重感染，也可能导致成人脑膜炎或败血症，并在健康成人的肠道和泌尿生殖系统中偶尔引发局部感染。研究者利用含有量子点的荧光纳米纤维，在初步检测到荧光阳性后，通过监测阻抗信号来定量识别细菌。这种方法结合了荧光和电化学检测的优势，能够有效提高对无乳链球菌的检测灵敏度，为临床提供快速、可靠的诊断手段。通过这种创新的传感器设计，研究者希望能够改善新生儿及成人感染的早期识别与治疗。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.snb.2021.130968