基于噬菌体蛋白的阻抗电化学生物传感器检测空肠弯曲杆菌

一、引言

空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）是一种微需氧的革兰氏阴性细菌，是禽类中常见的食源性病原体，能够引起人类的严重致命疾病。空肠弯曲杆菌的感染剂量很低，不到500 CFU/mL就足以引起疾病，除了引起血性腹泻外，感染这种病原体还可能导致格林-巴利综合征（Guillain–Barré syndrome, GBS），这是一种损害周围神经系统的自身免疫性疾病。

经济研究服务的研究人员估计，食源性病原体每年给美国经济造成155亿美元的损失，空肠弯曲杆菌感染造成的损失为19亿美元。这一估计仅包括与医疗保健、工作时间内的损失和死亡损失相关的成本。如果包括与食品产品召回、消费者兴趣丧失以及其他未计算成本相关的成本，由于食源性病原体造成的经济损失可能会更高。因此，开发准确和强大的检测方法，尽早在食品供应链中隔离和计数病原体是非常重要的。

尽管传统的检测方法，如标准的微生物学和生化测试，非常可靠、成本低廉、敏感，并且允许对病原体进行定性和定量评估，但这些方法需要实验室空间和熟练的劳动力，并且耗时，较长的测试时间导致了食源性病原体首次爆发到最终识别和验证之间的显著时间滞后。电化学生物传感器低成本、灵敏度、简单性以及易于小型化，在快速识别受污染食品样本中的微生物方面具有明显的优势，但其所使用的生物识别元件（抗体和酶）具有高选择性，但它们容易受到pH和温度变化的影响。基于噬菌体和受体结合噬菌体蛋白（receptor-binding phage proteins, RBPPs）的生物传感器是核酸和抗体基础生物传感器的可行替代品。噬菌体基础的生物传感器由于对目标生物的高度特异性而准确且特异性强。FlaGrab（以前称为GST-CCGp047）是由NCTC 12673噬菌体表达的RBPP，这种蛋白质识别与人类感染最相关的两种空肠弯曲杆菌物种——C. jejuni和Campylobacter coli的鞭毛蛋白。

二、电化学生物传感器检测C. jejuni

在过去的25年中，只有少数研究报告使用电化学生物传感器检测C. jejuni。这些研究主要使用抗体作为生物识别元件来检测C. jejuni。虽然表面等离子共振（SPR）传感器系统已被用于基于Campylobacter噬菌体蛋白的C. jejuni检测，但其依赖于复杂的SPR设备，使这种方法成本过高。

表1. 电化学生物传感器检测C. jejuni

三、生物传感器的制备和工作原理

电极制备过程，包括滴铸MWCNTs、交联剂PBSE、噬菌体蛋白CC-FlaGrab，最后添加0.1% BSA作为封闭剂。基底基质，玻璃碳电极（GCE），通过滴铸一层MWCNTs进行修饰。MWCNTs作为固定生物识别元件噬菌体蛋白的架构，PBSE被用来将噬菌体蛋白固定到MWCNT修饰的电极上，PBSE通过连接物将CC-FlaGrab连接到MWCNT的表面。PBSE的芳香族pyrenyl基团形成不可逆的π-π堆叠，并强烈附着在MWCNT的表面。由于PBSE与N末端胺基反应，它允许我们以一种方式定向蛋白质，以便与受体进行有效的相互作用。由于GST标签在N末端，与交联剂的化学反应对CC-FlaGrab的构象或结合位点的影响最小。由于蛋白质通过共价键与连接物连接，蛋白质流失的机会被最小化，并且蛋白质在各种pH和温度范围内都是稳定的。此外，CC-FlaGrab结合在C. jejuni的鞭毛亚基上展示的乙酰氨基修饰的假氨基糖酸，Pse5Ac7Am。一旦蛋白质固定完成，C. jejuni就被滴铸在电极上，并且不同浓度的C. jejuni与固定的电极一起孵化。最后，通过比较固定噬菌体蛋白前后的RCT差异，通过EIS完成了C. jejuni的检测。

图1. 用于固定噬菌体蛋白以检测C. jejuni的方法

四、研究方法与结果

在1x PBS缓冲液中测试了噬菌体修饰电极对不同浓度（10^2, 10^3, 10^5, 10^7和10^9 CFU/mL）的C. jejuni的阻抗生物传感响应。结果显示，阻抗响应的大小随着C. jejuni浓度的增加而增加。此外，采用电荷转移电阻（RCT）数据创建的分析物浓度校准曲线表明，在10^2到10^7 CFU/mL之间有近线性的可靠检测范围，并使用六西格玛方法估算了检测限（LOD）。结果表明，噬菌体蛋白修饰的生物传感器对C. jejuni的LOD为10^3 CFU/mL。

图2. 生物传感器的灵敏度检测

在有无CC-FlaGrab的情况下，目标和非目标细菌细胞的Nyquist图分别表明，噬菌体蛋白修饰的电极对非目标细菌细胞（L. monocytogenes Scott A和ser. Typhimurium-291RH）无响应。相比之下，C. jejuni 11168观察到显著变化。此外，在没有噬菌体蛋白的情况下，与非目标病原体L. monocytogenes Scott A相比，电极对C. jejuni 11168的RCT变化非常小。因此，基于噬菌体蛋白的生物传感器仅对目标细菌细胞有特异性。此外，SEM图像证实，C. jejuni选择性地附着在制造的生物传感器架构上，而L. monocytogenes 11168和ser. Typhimurium-291RH细胞（非目标）则没有附着在生物传感器架构上。这两个数据揭示了开发的基于噬菌体蛋白（CC-FlaGrab）的蛋白质架构对目标细菌细胞具有特异性。

图3. 噬菌体蛋白CC-FlaGrab在靶菌和非靶菌SEM中的特异性

五、结论

本研究报道了一种新型的阻抗噬菌体蛋白基生物传感器，使用基因工程改造的受体结合噬菌体蛋白FlaGrab作为生物识别元件，检测浓度为100 CFU/mL的空肠弯曲杆菌NCTC 11168。采用电化学阻抗谱（EIS）技术测量与空肠弯曲杆菌相互作用时的电阻变化。生物传感器的电荷转移电阻随C. jejuni 11168细胞数量的增加而增加。检测限确定为缓冲液中约为10^3 CFU/mL，体外样本中为10^2 CFU/mL。开发的生物传感器对靶标空肠弯曲杆菌NCTC 11168高度特异性，对非靶标细菌细胞未观察到信号。

参考文献：

Baviththira Suganthan, Ashley M. Rogers, Clay S. Crippen, et al. A Bacteriophage Protein-Based Impedimetric Electrochemical Biosensor for the Detection of Campylobacter jejuni[J]. Biosensors 2024, 14, 402.