一次性使用、代谢物吸收、共振换能器（SMART）培养容器实现无标签、连续细胞培养进展监测

分泌代谢物是一类重要的生物过程分析技术（PAT）靶点，可以与细胞条件相关。然而，目前测量代谢物的策略仅限于离散的测量，导致对反馈控制策略的理解和能力有限。在此，一个连续的代谢物监测策略是证明使用一次性代谢物吸收共振传感器（SMART）与细胞生长相关。聚丙烯酸酯可以吸收含有羟基和烯基的活细胞分泌的代谢物，如萜类，作为增塑剂。软化后，聚丙烯酸酯不可逆地形成共振传感器上方的工程空洞，改变局部介电常数，无接触，用矢量网络分析仪询问。与使用细胞固有介电常数进行传感相比，SMART方法在灵敏度方面提高了20倍。追踪多种细胞类型的生长，如中国仓鼠卵巢、HEK293、K562、HeLa和大肠杆菌细胞的生长，以及在药物筛选过程中细胞增殖的扰动。该传感器的基准是显示超过6天的连续测量，跟踪不同生长条件的能力，将活性细胞生长代谢物转导到培养基中其他成分的选择性，以及扩展到高通量活动的可行性。

关键发现：

1、 直接报告细胞生长的共振传感器-工作原理

图1 直接耦合的共振传感器的传感原理

谐振传感器，也被称为无源LC传感器，通过感应耦合进行无线询问。该系统由图形传感器线圈和读取器天线组成，并连接到读取器（矢量网络分析仪或自定义阻抗板），该读取器扫描频率并观察反射或传输功率的变化。传感器线圈具有固有的电感和寄生电容（LC），在电感耦合下，在特定的谐振频率振荡。这些传感器被调谐到在短波无线电频谱中工作，以平衡传感器的大小和通过细胞生长介质传输更长距离的能力。当将共振传感器应用于细胞培养传感时，可以采用两种信号转导模式。

2、 薄涂层谐振传感器对细胞生长的敏感性较低

图2 由与周围介质的固有细胞介电常数对比引起的共振传感器对活细胞的敏感性的研究

共振传感器对周围的电导率高度敏感。高电导率的环境可以降低传感器的质量因素，如培养基。因此，需要一个绝缘层来保存传感器信号。利用仿真（Ansys HFSS），研究了传感器系统，以生成设计指南，以实现对细胞的最大灵敏度。在传感器和绝缘体上方有一层薄薄的（3 μm）层被用来模拟融合的细胞层。模拟了薄电池层不同介电常数产生的谐振频率。由于周围介质的介电常数减小，谐振频率的介电常数减小，共振频率的变化增大。此外，较厚的绝缘子（传感器涂层）降低了传感器的灵敏度，这从较低的绝缘子厚度下更陡的曲线可以看出。该模拟显示，在增加绝缘厚度以保持传感器信号强度和保持绝缘厚度足够薄以检测细胞并保持较大的传感器增益之间存在平衡。

在确认了对细胞的敏感性后，研究人员继续监测细胞在其天然体外培养环境中的生长。研究人员将细胞放在G-Rex10中培养，并测量细胞接种后4天的共振频率变化。不幸的是，共振频率响应是0.9 MHz噪声水平的控制容器（没有细胞接种）由于暴露传感器容易受到许多背景因素，如湿度和温度变化，导致背景信号漂移覆盖大部分的传感器响应特别是在低细胞浓度。传感器的稳定性可以进一步提高，通过背面涂层，防止环境波动，以保护，尽管这将限制信号强度，响应仍然将限制在几兆赫的位移。因此，研究人员将注意力放在了先进的材料上，以增加传感器的增益（频率转移到等效细胞生长的程度）。

3、 丙烯酸粘合剂对分泌体机械敏感性的研究

图3 智能培养皿的工作原理和选择性筛选。

如上文所示，细胞生长可以通过共振传感器使用细胞对介质的固有介电常数差异来直接监测，然而，由于细胞内部介电常数的微小变化和要求保持传感器靠近细胞生长区域，这种方法的敏感性有限。在初步测试后，研究人员使用聚丙烯酸酯粘附膜作为生物分子响应材料来放大信号，因为其抗溶剂（在长细胞生长实验中不会启动）和已发表的增塑剂的程度。聚丙烯酸酯在与萜烯和某些碳氢化合物树脂等增塑剂混合时具有可调的模量。由于已知生物细胞可以分泌多种碳氢化合物分子，研究人员采用了一种不确定的筛选方法（针对一系列具有特定官能团的分子，而不是单个分子），通过检测在细胞培养中发现的生物分子的聚合物性质。浸渍聚合物的相对介电常数可能有很小的变化，但由此产生的机械变化可以转化为更大的谐振频移；聚丙烯酸酯粘合膜被应用在盘子中的导线缠绕谐振传感器上，故意在导线周围产生空隙。当聚丙烯酸酯薄膜吸收生物标志物时，它会塑化和软化，关闭空气空隙，当机械性能发生变化时，它会产生强烈的介电常数对比（从E_air≈1到E_adhesive≈5和E_media≈80）（图3a，右）。这个由此产生的原型被简化为一个一次性的代谢物吸收谐振传感器（SMART）系统。

4、 聚合物对生物分子的力学响应的验证

图4 聚丙烯酸酯薄膜对代谢物暴露的机械响应和表征

接下来，研究人员验证了将这层膜暴露在分泌的生物分子中，会导致机械变化，正如研究人员在研究人员的机制中所假设的那样（图3a）。研究人员将粘合剂薄膜分层放置在带有图案通道的聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜上，以产生空气空隙（图4a）。在细胞存在的情况下，粘附剂与分泌的生物分子相互作用，其力学性能的变化会导致粘附膜进入空隙中（图4b）。在引入细胞的设置中，研究人员确实观察到聚合物膜与空隙相一致，而仅在培养基中孵育的膜则不符合（图4c，d）。这证实了对细胞培养的机械反应，并表明了由这种反应导致的介电常数的变化。为了进一步评估其力学性能，研究人员获得了聚丙烯酸酯的流变学信息。在新鲜培养基或细胞悬浮液中暴露4天后，与未处理的聚丙烯酸酯相比，聚丙烯酸酯的复合模量（G*）和相角（δ）都更低（图4e，f）。与仅介质暴露相比，细胞悬浮液中处理过的聚丙烯酸酯表现出更低的G*和δ，这表明由于细胞暴露的聚丙烯酸酯的增塑程度更高，聚丙烯酸酯的刚度降低和更强的弹性行为。

5、 聚丙烯酸酯粘合剂作为信号放大器的细胞生长时耦合谐振传感器

图5 SMART对细胞生长和死亡的反应

图6 在不同生长条件和细胞系下的传感器响应的SMART高通量设置和表征

虽然没有一种代谢物能提高CHO的生长速率，但有一些代谢物显著降低了乳酸的积累（图4）。特别是，多种2-羟基酸使乳酸的产量降低了高达60%，例如，在5 mM时，2-羟基异戊酸，而没有显著影响细胞生长（图4B）。在向细胞培养中添加2-羟基酸的实验中，研究团队没有只观察到乳酸产量减少，但也减少了其他2-羟基酸的积累（图5）。此外，补充2-羟基酸会导致下游代谢副产物的水平显著升高，这将需要将2-羟基酸转化为2-酮酸。例如，补充2mM2-羟基-3-甲基戊酸使2-甲基丁酸水平增加了两倍，补充2 mM苯乳酸使苯乙酸水平增加了15倍，补充5 mM 2-羟基异丙酸使异戊酸水平增加了两倍，补充5mM2-羟基丁酸使2-氨基丁酸水平增加了12倍（图5）。研究团队发现，LDH不仅将乳酸转化为丙酮酸、天然的2-羟基酸和2-酮酸底物/产物，而且还将其他8种2-羟基酸以较高的速率转化为各自的2-酮酸（图6）。虽然这些结果并不排除其他脱氢酶可能也会参与CHO细胞培养中2-羟基酸的产生，但它确实表明，鉴于LDH在CHO细胞中的高表达，它可能是参与这些转化的主要酶。

为了定量比较细胞膨胀对共振频率的响应，研究人员通过人工注释HeLa细胞显微图像计算了融合度，在此期间进行了共振传感器测量。与预期的一样，在播种浓度为30 000、45 000和60,60 000 细胞−2时，共振频率和一致性曲线都表现出不同的响应（图6f）。请注意，一致性剖面被绘制为负值，以匹配共振频率剖面的趋势。与共振频率的快速变化相比，一致性曲线的增长更具线性、更早，这表明目标代谢物是在更成熟的生长阶段分泌的。此外，融合度和共振频率前文件几乎保持稳定，特别是30 000个细胞厘米−2的轮廓。对于30 000个细胞cm−2的播种浓度，稳定信号表明养分耗尽，这一特征可能用于生物过程监测（需要改变培养基的信号）。在较高的播种浓度下，融合度最终达到饱和，无法通过显微图像进一步量化。由于显微图像的自动分割已被用作一种细胞进展技术，SMART系统提出了另一种具有更高可检测范围的方式，而且不局限于单层培养。

6、 传感器对其他细胞系的响应

尽管SMART装置显示出了令人鼓舞的结果使用HeLa细胞系，评估相同的代谢物分泌转导方法是否适用于其他方法是至关重要的普通细胞系。时观察到相似的反应曲线用HEK293、K562、Jurkat、中国仓鼠卵巢细胞和大肠杆菌。这表明SMART盘可能是适用于真核生物和原核生物，以及附着物悬浮细胞类型。接下来，研究人员试图通过OD₆₀₀测量大肠杆菌生长的共振频率基准。培养≈4h后，共振频率进入快速变化阶段。一致地，OD₆₀₀测量显示，共振频率的快速变化发生在指数相位（图6g）。根据OD₆₀₀曲线，培养物大致在11 h时进入固定阶段。虽然由于不可逆转导机制，无法区分OD₆₀₀的下降，但谐振频率分布在固定相位附近趋于稳定。有趣的是，当相同的培养悬浮液（共振频率稳定后）转移到新的SMART培养皿中，即使细胞培养的OD₆₀₀没有进一步增加，共振频率也逐渐降低，最终趋于稳定。由于细菌以弹性而闻名，由于细菌死亡率补偿，OD₆₀₀没有增加，但细菌很可能仍在分裂和分泌代谢物。

7、 SMART信号的一致性与表征

在调查智能系统的特点后，研究人员试图检查传感器的一致性和可靠性通过多个传感器（n = 3和3.5厘米）到一个9厘米盘子消除潜在的变化从不同的文化和调查传感器的一致性。研究人员培养K562细胞，播种浓度分别为0.1、0.167和0.50万个细胞mL⁻¹（常规细胞计数单位切换为每体积单位）。所有三种条件都产生了如上所述的s型响应。

8、 药物筛选应用

为了证明SMART培养皿在药物发现中的应用，研究人员研究了细胞培养过程中传感器对马利司他的反应。马里马司他是一种广谱基质金属蛋白酶和金属蛋白酶分解素的抑制剂，这些蛋白酶通过中断细胞通信对细胞增殖产生影响。细胞功能的中断可导致生物过程的减少，并被假设为有代谢物分泌的减少。首先建立SMART培养皿，并接种60000个HeLa细胞cm⁻²。接种20 h后，将马利马司他分别在0（对照）、7.5、15和30 μm（最终浓度）的4个培养皿中，并持续培养4天。

表3 马利司他治疗HeLa细胞培养的参数分析

结论

在本研究中，一种新的基于聚合物吸收连续代谢物的监测方法已经被开发出来。分泌的代谢物可用于跟踪细胞生长等生物过程；然而，目前的代谢物监测策略依赖于间歇性采样，不适合连续监测。在此，研究人员利用交联聚丙烯酸酯对含有C═C和O─H官能团的分子的亲和力，如分泌的萜类化合物；这些以浓度依赖的方式使聚合物塑化。通过将该膜与共振传感器耦合，将机械变化转化为共振频率的变化，研究人员展示了SMART培养皿，它可以通过非破坏性、连续的代谢物吸收来连续监测封闭血管内的代谢物。SMART系统导致了超过30 MHz的共振频移，与仅通过固有的细胞介电常数进行感知相比，灵敏度增加了20倍以上。SMART培养皿信号成功地与细胞增殖和细胞生长中断相关。动态响应曲线随后能够提取多个参数，表明培养条件，如起始细胞浓度和抑制药物效应。无线接口、可伸缩性和高采集率应该使其在药理学发现和生物制造方面的应用成为可能。

原文：Chan, Y. J., Dileep, D., Rothstein, S. M., Cochran, E. W., & Reuel, N. F. (2024). Single-Use, Metabolite Absorbing, Resonant Transducer (SMART) Culture Vessels for Label-Free, Continuous Cell Culture Progression Monitoring. Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany), 11(32), e2401260. https://doi.org/10.1002/advs.202401260