基于纳米运动和深度学习的快速AST新方案

AMR是全球公共卫生面临的严峻挑战，导致治疗选择减少，患者死亡人数增加。不恰当的抗生素使用加速了AMR的发展，而快速准确的抗生素敏感性测试（AST）对于指导临床合理用药、抑制AMR的进一步发展至关重要。传统的AST方法依赖于细菌生长指标，耗时长，不适合快速临床决策。纳米运动技术是基于原子力显微镜（AFM）的一种技术，它提出了一种潜在的方法来克服传统抗生素敏感性测试（AST）的局限性，通过非生长依赖的方式测量细菌的活性和对抗生素的反应。在这种技术中，一个功能化的微悬臂梁会响应细菌的振动而振荡。改变细菌振动的条件，例如药物暴露，会调节微悬臂梁的振荡，而这些变化可以通过光学读出系统检测、测量和输出。纳米运动技术能够区分耐药和敏感细菌对抗生素治疗的不同反应，并已经被用于检测包括肠杆菌科、金黄色葡萄球菌、结核杆菌和白色念珠菌在内的多种微生物的抗生素敏感性。然而，这些研究主要提供了纳米运动AST的概念验证，使用实验室原型研究少数敏感和耐药的参考菌株。到目前为止，抗生素对细菌的影响是通过量化微悬臂梁位置随时间的变化来分析的。为了解决临床环境中遇到的菌株多样性、最小抑制浓度（MICs）范围广泛以及对给定抗生素反应多样的问题，需要扩展纳米运动信号的分析工具集，以开发出临床相关的AST。基于此背景，Alexander Sturm等人提出了一种基于纳米运动和深度学习的快速AST新方案。该方案利用Resistell AG公司的PHENOTECH设备采集微悬臂梁的振荡变化，并结合监督式学习明确相应的信号参数（SPs），可在4 h内对大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌针对头孢曲松（CRO）、环丙沙星（CIP）、头孢克肟（CTX）和头孢他啶-阿维巴坦（CZA）进行敏感/耐药界定，图1。

不同于传统的系列浓度梯度抗生素使用，本方法着重于研究高于临床断点的一个单一抗生素浓度下测量细菌的纳米运动，以快速观察抗生素的效果。作为例证，作者利用2例大肠埃希氏菌：CRO敏感ATCC-25922和CRO耐药BAA-2452初步探索了方案的可行性。与之前的研究一致，与32 μg/mL CRO共孵育后，ATCC-25922菌株的纳米运动方差随时间减少，而BAA-2452菌株的纳米运动方差则急剧增加（图1 d）；在这里，以往研究中常将“培养基阶段和药物阶段方差的平均值的比率”作为菌株敏感/耐药的SP，尽管这个参数在临床分离株中的应用区分度不够。基于此，作者描绘了细菌对不同浓度抗生素的剂量反应模式，以此：①确定最佳抗生素浓度，以便在临床设置中区分敏感和耐药细菌；②通过分析不同浓度下的数据，并识别出最能区分敏感和耐药细菌的信号参数（SP），如方差的斜率变化。在SPs的筛选上，作者引入了机器学习算法，从不同的菌株和抗生素组合的4小时纳米运动记录中提取了成千上万的SPs，并使用logistisc回归对识别出的SPs进行整合，生成一个评分，其中正值表示预测敏感，负值表示耐药；由此来实现仅通过最少的SPs实现最大化的分析精度。基于各个菌株-抗生素组合的SPs，作者进一步利用PHENOTECH-1纳米运动技术平台，对352个大肠杆菌和肺炎克雷伯菌分离株对4种目标抗菌素进行反应分析，并与传统的基于生长的方法进行了性能比较。结果显示，通过增加算法复杂性至帕累托最优，即在增加固有SPs的数量直至性能饱和，最终的PHENOTECH纳米运动AST模型在独立测试数据集上取得了从CIP的89.5%到CRO的98.9%的准确率（图2），以及基于2小时记录的CZA的93.0%准确率（图3）。

总的来说，本研究开发的纳米运动技术平台为AST提供了一种新方法，它不依赖于细菌生长的评估。该平台通过直接处理阳性血培养样本并测量细菌细胞振动，能够在2到4小时内生成结果，远快于现行AST方法所需的24小时。研究中开发的基于机器学习的分类模型在独立测试中显示出高准确率，证明了该技术的有效性和普适性。由于该方法不依赖于生长参数，固定记录时长和自动化数据处理流程确保了实验之间的时间到结果（TTR）的标准化。此外，该技术适用于评估生长缓慢的细菌，如结核杆菌，以及许多病原体中的非生长表型，为抗生素耐受性提供了测量手段。不过，值得关注的是，本研究定位的“测试浓度”不等于传统方法定义中的MIC值，也就是说，本方法仍处于一个简单的定性阶段。此外，尽管研究涵盖了一定数量的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌分离株，但可能未能全面代表所有类型的细菌和抗生素反应，且尚未包括多重感染样本的分析。因此，尽管此方法是一种有潜力的快速AST新方案，但其从实验室环境向实时临床应用的转移可能面临额外的挑战，包括样本处理、设备操作和结果解释等。

图1  （a-b）纳米运动技术平台组件及纳米运动检测与记录装置示意图。（c）革兰氏阴性菌附着在悬臂梁上的示意图。在附着之前，细菌分散在凝胶琼脂糖中，而悬臂表面使用带正电荷的聚d-赖氨酸功能化。该胶凝剂有利于细菌附着的均匀分布和稳定性。（d）两例大肠杆菌参考菌株：ATCC-25922（敏感）和BAA-2452（耐药），在50% LB培养基中培养2 h后（培养基阶段），再与32 µg/ml CRO共孵育2 h（药物阶段）后的纳米运动记录。

图2 （a）左图：用于开发CRO模型的160株大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌的MIC分布。图中的虚线表示CRO的浓度，即MIC条带测试中使用的抗生素浓度。右图：根据纳米运动AST和4个SPs模型进行分类的结果，其中MIC条带测试作为参考标准。（b）左图：用于开发CIP模型的127株大肠埃希氏菌的MIC分布。右图：根据纳米运动AST和4个SPs模型进行分类的结果，同样以MIC条带测试作为参考标准。（c-e）CRO和CIP模型的训练和测试性能，包括准确率、敏感性和特异性，其中纸片扩散法作为参考方法。

图3  （a）2小时纳米运动记录中46个大肠杆菌和肺炎克雷伯菌分离株的MIC分布。图中的虚线表示头孢曲松的浓度。（b）基于纳米运动AST和6个SPs的模型在独立测试集上的测试结果，该测试集包含了21个不同的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌分离株。图中展示了MIC分布以及每个记录的得分。（c）2小时CZA模型的训练和测试性能，包括准确率、敏感性和特异性。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-46213-y