构建来源于人类肠道类器官的肠干细胞的化学定义和可扩展的培养系统

原创

来源：牛沁雅

2024-12-13 11:03:09

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核心提示：韩国科技大学韩国生物科学和生物技术研究所（KRIBB）Mi-Young Son研究团队在Nature Communications上发表的研究成果，建立了一种人肠道干细胞（ISC）培养方法。

人体肠道类器官(hIOs)由于具有自我更新和分化能力，可以模拟肠道的简化结构和功能。因此已成为研究人类肠道发育和功能特性的体外模型系统。由于肠道干细胞来源的类器官结构不规则，且在可重复性和大规模培养的方面受到限制，因此不具有广泛实用性。

韩国科技大学韩国生物科学和生物技术研究所（KRIBB）Mi-Young Son研究团队在Nature Communications上发表的研究成果，建立了一种人肠道干细胞（ISC）培养方法：①在来自人多能干细胞的 hIO 内选择性富集 ISC 群体（ISC^3D-hIO），于无饲养层和完全定义的条件下扩增。②ISC ^3D-hIO 的内在自组织特性与最低限度限定培养基中的气液界面培养相结合，迫使 ISC ^3D-hIO 分化为具有细胞多样性、绒毛样结构和屏障完整性的肠上皮。③ISC ^3D-hIO 是基因编辑的理想细胞来源，用于研究 ISC 生物学和肠道疾病的移植。④ISC ^3D-hIO分化的肠上皮细胞作为研究严重急性呼吸综合征冠状病毒2型病毒（SARS-CoV-2）感染的模型系统，该培养技术为再生医学和疾病建模提供了生物学工具。

研究结果

1. 用于人ISC的化学成分明确的无饲养层的2D培养系统

检测ISC ^3D-hIO形态、细胞数、干细胞标记基因和分化细胞的相对表达，确定ISC ^3D-hIO可以在涂有1%基质胶的表面上有效地生长和增殖（图1）。

开发了化学成分完全确定的无饲养层细胞的培养系统（补充表1）。

图1 2D ISC^3D-hIO培养方法的建立

培养基中补充生长因子和调节因子RSPO 1、EGF和PGE 2对于ISC ^3D-hIO培养是必不可少的（图2）。

培养的类器官在连续传代及反复冻融过程后均显示出高回收率和活力；全基因组测序结果显示，整个基因组保持高度稳定且无结构变异（图2）。

图2 ISC^3D-hIO 培养基的优化

2. ISC 3D类器官单细胞细胞组分分析

单细胞RNA测序检测细胞组分，通过对上皮细胞标记物和间质细胞标记物、细胞周期以及与胎儿ISC标记基因的表达发现ISC^3D-hIO主要由干细胞和祖细胞构成，分化的细胞相对较少（图3）。

图3 scRNA-seq 分析ISC ^3D-hIO 组成特征

3. 利用气液界面（ALI）培养技术分化2.5D 肠上皮细胞

Transwell进行类器官的气液界面培养，使细胞分化为具有绒毛样突起结构的肠上皮。培养第四天， ISC的干性标志物表达减少，分化标志物表达上升、H&E染色切片显示绒毛样褶皱的厚度及跨上皮电阻（TEER）值随培养时间而增加。

RNA-seq结果显示ALI培养的类器官与其他组表现出不同的基因表达；但功能注释聚类表明，与肠上皮发育和成熟相关的其他生物过程在ALI分化细胞中显著上调。

对比发现在ALI条件下，ISC ^3D-hIO具有分化为功能性肠上皮的能力，且分化程度高于正常条件下培养的ISC ^3D-hIO。

图4 通过 ALI 将 ISC ^3D-hIO 分化为肠上皮细胞

4. ISC ^3D-hIO 在基因编辑和移植中的应用

利用慢病毒转导创建基因编辑后的类器官系，将类器官解离为单细胞后，在涂覆有1% Matrigel的平板上进行培养后，通过ALI培养可以顺利分化为可以被标记的3D hIOs和2.5D肠上皮模型。即ISCs^3D-hIO可以应用于基因组编辑以构建稳定的细胞系（图5）。

将ISC ^3D-hIO移植到EDTA损伤的小鼠结肠上皮中，观察其再生潜力。结果显示，ISC^3D-hIO移植组在原位表现活跃，肠道重量以及损伤程度均有改善，在植入部位隐窝结构形成、粘蛋白分泌，与Matrigel组相比显著提高。表明ISC ^3D-hIO可以成为肠上皮结构组织再生的来源（图6）。

图5 表达 eGFP 的 ISC ^3D-hIO 细胞系

图6 ISC ^3D-hIO 异种移植到 EDTA 诱导的上皮损伤小鼠模型

5. SARS-COV-2感染ALI分化肠上皮细胞的模型研究

分别使用了来自胎儿和成人来源的2.5D肠上皮细胞和3D类器官，并保留了其来源 hIO 的肠道成熟特异性基因表达谱。SARS-CoV-2 感染后检测病毒 RNA，发现ISC^{3D-mature hIO}相对于ISC ^{3D-control hIO}更易感染，并且在给予化学药物后，发现病毒的感染收到显著抑制。即该模型可以作为病毒感染模型并可以进行治疗方案及药物筛选。