Nano LC-HRMS：精准分析样品中蛋白质的利器

在新冠肺炎疫情期间，疫苗接种数量最多的是安全性高、生产技术成熟的灭活疫苗。其中灭活疫苗和重组疫苗都是通过病毒靶蛋白的免疫刺激生产抗体，而S蛋白是COVID-19病毒中能够刺激人体产生抗病毒抗体的蛋白，因此，S蛋白的测定对疫苗产品的质量控制具有重要意义。同时，在疫苗生产过程中不可避免地引入宿主细胞蛋白残留（Host Cell Proteins，HCPs）。这些HCPs可引起未知的免疫反应，可能对免疫受体产生严重的毒性和副作用。因此，有必要对此类疫苗制品中的HCPs残留进行检测。

近日，赵恒志等人建立了一种基于纳升液相色谱-高分辨率质谱（Nano LC-HRMS）的COVID-19疫苗定量蛋白质组学分析方法，用于同时分析COVID-19灭活疫苗产品和重组疫苗产品的S蛋白和HCPs残基。在此基础上，该方法可以根据标配的标准蛋白定量S蛋白和HCPs残基的含量。

检测步骤如下：

A． 疫苗样品及标准品的酶解

首先，在100µL疫苗样品中加入10µL Pierce完整蛋白标准混合溶液和110µL RapiGest SF。轻轻混合后，在60℃下保存15 min。然后在上述混合物中加入10µL DTT，在60℃下再孵育60 min。冷却至室温后，加入10µL IAA，在室温下黑暗保存30 min之后，将所有混合物转移到3K超滤装置中，在21000×g离心力下离心10 min。然后加入100µL NH4HCO3缓冲液进行新一轮超滤。共超滤两次。随后，将100µL NH4HCO3缓冲液和10µL胰蛋白酶加入上述超滤装置的上腔中，轻轻混合。37℃酶解过夜后，加入3µL甲酸，在21000×g离心力下离心10 min。最后收集滤液进行LC-MS分析。

对照实验，初始取10µL Pierce完整蛋白标准混合溶液与110µL RapiGest SF混合。以下过程与疫苗样品相同。

B． LC-MS

C． LC-MS数据分析

检测方法特点：

研究者根据该方法成功分析了两家公司的15批次COVID-19灭活疫苗样品和一家公司的12批次COVID-19重组蛋白疫苗样品的蛋白质组，提供了大量有价值的信息。并且不同批次或不同公司生产的样品可以通过这种方式进行系统对比，为现有的质量标准提供有力的补充。该研究为复杂样品的蛋白质组学分析提供了技术支持，并为生物大分子药物的质量评价打开了新的视角。该检测方法的特点如下所示：

1. 优良的选择性

图 1 Nano LC-MS法检测不同非COVID-19疫苗样品中的靶蛋白

图1说明：左栏：作为靶蛋白的COVID-19结构蛋白，未见属于COVID-19结构蛋白的峰值。右列：6个标准蛋白作为目标蛋白。光谱中都可以找到属于这6种标准蛋白的峰（6种颜色分别代表6种标准蛋白，如上图所示）。

通过对非covid -19疫苗样品F和G的分析，验证了该方法的选择性。如图1所示，当将COVID-19结构蛋白定义为靶蛋白时，这两种疫苗样品中均未检测到靶蛋白。但是，如果以标准蛋白为目标，则结果中可以观察到所有六种蛋白质标准物质。结果表明，该方法具有良好的选择性，在多种蛋白质分析中具有广阔的应用前景。

2. 可重复性强

图 2不同疫苗样品中6种标准蛋白的相对标准偏差（RSD）

通过测定不同疫苗样品中6种标准蛋白的相对标准偏差（RSD），验证了方法的重复性。6种标准蛋白的RSD值分别为1.7%、4.1%、2.6%、5.9%、3.1%和5.5%，4种样品的RSD值无显著差异（图2）。方法重复性满足分析要求。

3. 精确度高

根据6种不同的标准蛋白，分别计算出6次独立进样的RSD值分别为7.71%、7.66%、8.66%、5.14%、6.14%和8.23%，说明进样精度较好。

4. 灵敏度高

根据内标蛋白计算蛋白质的最小丰度浓度为1 pM。

总结：

1. 液相色谱-质谱（LC-MS）是一种具有高选择性、高灵敏度和高通量特点的分析技术，具有快速开发方法的优势，因此更适合于流行病等紧急情况，也避免了抗体特异性差等风险；

2. 由于其通用性，Nano LC-MS方法可用于生产过程中的全局监测（例如，病毒/宿主细胞代谢，MOI优化等）；

3. 解决了目前ELISA方法不能同时分析S蛋白和HCPs的含量导致检测的程序和时间较长的问题。

4. Nano LC-MS技术在蛋白质组学领域的进步使得对复杂样品中蛋白质进行准确的定性和定量分析成为可能，对今后改进疫苗生产技术有一定的参考价值。

原文链接：https://doi-org-s.vpn.scau.edu.cn/10.3390/vaccines12091055