用扫描电化学显微镜检测人成纤维细胞中的细胞色素c氧化酶缺陷

细胞色素c氧化酶缺乏症（COXD）是一种遗传性疾病，其特征是编码细胞色素c氧化酶蛋白（COX）的基因缺失或突变。COX缺乏会导致严重的肌肉无力、心脏、肝脏和肾脏疾病，以及婴儿和青少年的脑损伤，在许多病例中导致死亡。由于没有治愈这种疾病的方法，找到一种有效、廉价和早期的诊断方法对于减少症状和长期残疾至关重要。此外，肌肉活检，一种传统的检测方法，具有侵入性、昂贵和耗时的特点。本研究证明了扫描电化学显微镜在定量活的人成纤维细胞中COX活性中的适用性。利用氧化还原介质N、N、N’、N’-四甲基-对苯二胺和COX之间的相互作用，利用铂微电极监测电流变化，并通过数值模型确定表观异相速率常数k₀，成功地定量了酶活性。本研究为建立一种检测婴儿中COXD的诊断方法提供了基础。

关键发现

1、 COX氧化还原机理与TMPD电化学

图1 细胞和电化学反应的示意图表示

如图1A所示，在正常有氧条件下，COX催化电子从还原的细胞色素c转移到分子氧，产生水和氧化的细胞色素c，同时每个电子将一个质子从基质转移到膜间线粒体空间。同时，细胞色素c氧化还原酶或复合物III（CRE）为每个电子泵出两个质子，同时催化电子从泛素醇（QH2）转移到氧化的细胞色素c，使细胞色素c恢复到其还原形式。细胞色素c一次只能转移一个电子；因此，为了产生一个水分子，细胞色素c必须进行两次还原。

2、TMPD与活成纤维细胞相互作用的电化学监测

图2 在含有1 mM TMPD的碱性DMEM培养基中，以50 μm⁻¹扫描速度进行单个活成纤维细胞的SECM三维成像

图3 SECM线扫描在含有1 mM TMPD的基本DMEM介质中的单个活对照（A和B）和SCO1（C和D）成纤维细胞，扫描速度从10到100 μm−1，微电极偏置在+200 V（A和C）和−200V（B和D）

本研究中使用的两种成纤维细胞系包括一个健康成纤维细胞的对照细胞系（对照），能够表达一个完全组装和功能的COX酶。SCO1细胞携带SCO1基因突变，该突变破坏了COX的适当生物合成。两种细胞类型表现出相似的形态，其特征是一个细长的形状和纤维状的外观。为了验证所选择的细胞系，Western blot分析Contorl和SCO1细胞系中完全组装的COX和SCO1蛋白的表达水平。图2a所示的SDS-PAGE结果证实了SCO1细胞中SCO1蛋白（29 kDa）水平的降低。以VDAC1（35 kDa）作为加载对照，在两种细胞系中检测结果相同。因此，蓝色原生液凝胶电泳（BN-PAGE）结果（图2B）显示，由于携带SCO1蛋白水平的降低，携带SCO1突变的细胞出现了完全组装的COX（ComtelIV）水平的降低。

3、表观非均匀速率常数（k0）的提取

图4 使用SECM分析对照和SCO1成纤维细胞的数值模拟结果的总结

通过数值模拟，活成纤维细胞与COX和CRE相互作用后在微电极上发生的TMPD氧化和TMPD⁺还原可以分析表观异质速率常数（k₀），该常数代表生物细胞动力学。图5显示了Control和SCO1成纤维细胞的归一化尖端电流作为P_s的函数（分别为图5A和C）。对于COX和CRE活性，SCO1值均低于对照值，证实了SCO1成纤维细胞的动力学速率较慢（图5B和D）。

4、通过叠氮化钠COX抑制生物测定法验证结果

图5 COX抑制试验

通过分光光度生物测定法测定对照组和SCO1成纤维细胞中COX的活性，验证了SECM和数值模拟的结果。该检测方法是通过固定在微孔板上的COX特异性抗体捕获存在于全细胞提取物中的COX酶，然后每个孔（n = 3）添加细胞色素c溶液。在550 nm处的吸光度下降（细胞色素c的吸收波长）表明其酶活性。生物测定结果（图6B）显示，与对照组细胞相比，SCO1成纤维细胞的COX活性明显低于对照组细胞（P < 0.01），这与文献完全一致。在SECM线扫描（图6A和数值建模（图6B）中也可以看到叠氮化钠存在时COX活性的下降。

结论

在本研究中，研究人员提出了SECM作为一种很有前途的和有效的方法来检测和量化活成纤维细胞中COX的活性，并作为COXD的生物标志物。所提出的电分析方法是使用成纤维细胞作为模型细胞系，并基于定量由氧化还原介质TMPD与COX在细胞内的相互作用所产生的电流变化。利用数值模型提取了单个成纤维细胞周转TMPD/TMPD^+ž的表观非均匀速率常数。细胞反应动力学的研究成功地解耦了细胞反应性和细胞形貌对整体生物电化学反应的影响，从而深入了解对照和SCO1缺陷细胞之间的COX活性差异。与健康对照细胞相比，SCO1细胞系的TMPD/TMPD^+ž再生速度相当慢，这使该SECM方法成为检测人类细胞中COX活性的可靠方法。此外，这种方法可以在基本的SECM组件上进行，并且不需要专门的模块，如剪切力。研究表明，电化学结合数值建模为区分正常和功能失调的COX形式提供了一个强大的组合，从而导致COXD的发展。在后续研究中可以通过微创方法获得的细胞样本中验证这一组合，为创建用于COXD临床诊断的生物传感系统提供潜力。

原文：Thind, S., Lima, D., Booy, E., Trinh, D., McKenna, S. A., & Kuss, S. (2024). Cytochrome c oxidase deficiency detection in human fibroblasts using scanning electrochemical microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 121(1), e2310288120. https://doi.org/10.1073/pnas.2310288120