Research. : 从中国地方宝藏猪种民猪中靶向筛选暹罗芽孢杆菌来改善宿主结肠炎

前言

炎症性肠病 （IBD） 是指胃肠道的慢性和复发性炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎 （UC） 和克罗恩病 （CD）。UC 是一种现代难治性 IBD，易发生间歇性腹部绞痛和血性腹泻的反复发作，通常需要长期治疗。IBD 可能会对患者造成实质性的精神和身体伤害，严重损害他们的生活质量，并导致巨大的个人和经济成本。有多种药物可用于治疗 IBD，如皮质类固醇、免疫抑制剂、抗生素和生物制剂，但它们可能不适合长期使用。此外，这些药物通常会引起不良副作用，例如腹泻、恶心、发烧和腹痛。因此，应考虑寻找一种更环保、副作用更少的治疗策略。

哺乳动物肠道微生物群包括数万亿种维持宿主健康的微生物。微生物群宿主免疫应答阻止肠道病原体的形成，并对特定药物产生反应或改变特定药物。最近的研究表明，IBD 的发生和发展与肠道微生物表型的差异有关，尤其是需氧菌和兼性厌氧菌的组成 。此外，有证据表明，恢复肠道微生物群对于预防和降低 IBD 易感性至关重要。粪便微生物群移植 （FMT） 已显示出通过调节肠道微生物群和代谢途径缓解 UC 的前景。然而，尚不清楚肠道微生物是否会诱导微生态变化并导致这些影响。值得注意的是，FMT 的应用需要对供体粪便中的病原体进行严格筛查。这意味着 FMT 的功效在整个微生物群落中并不统一;相反，微生物群可以分为核心有效微生物和其他共生细菌派系的一个子集。这些核心微生物可以通过在 FMT 期间表现出不同的表型或相对丰度来发挥其影响。例如，胡 将粪便微生物群从丛微型 （CM） 仔猪转移到 LY 仔猪，并确定脾脾乳杆菌和加氏乳杆菌 LA39 是介导腹泻耐药性的关键细菌菌株。这些发现表明，核心微生物在个体中高度代表性，并且主要驱动 FMT 的功能结果。因此，靶向这些核心微生物以操纵肠道微生态可能成为 IBD 治疗的一种有前途的策略。

约克夏猪是世界范围内常见的商品猪品种，民猪是中国本土品种，抗病能力强于约克夏猪。作者以前的研究表明，民猪对葡聚糖硫酸钠 （DSS） 诱导的 UC 表现出比约克夏猪更大的抵抗力，这可以从较低的疾病活动指数 （DAI） 和较低的组织学损伤评分中得到体现，这可能归因于其肠道微生物群的稳定性和持久性。患病的民猪富含潜在有益微生物，而约克夏猪表现出更丰富的潜在有害微生物。通过从健康的民猪到约克夏猪的 FMT，作者进一步证明了民猪肠道菌群在改善受体猪免疫球蛋白和抗菌肽水平方面的关键作用。因此，筛选民猪的肠道微生物群为识别可以提高宿主对 IBD 的抵抗力的功能性核心微生物提供了机会。

DSS 诱发的结肠炎是一种公认的急性结肠炎症模型，其特征是类似于人类 UC 中观察到的溃疡。在这项研究中，作者调查了患有 UC 的民猪和约克夏猪微生物群落组成的变化。作者研究了肠道微生物群变异性和生理条件，以确定候选核心微生物。根据核心微生物的表型和功能进行选择，体外试验证实了候选微生物的抗菌特性、定植能力和生物安全性。使用常规和微生物群缺陷小鼠，作者评估了核心微生物 B. siamensis MZ16 是否对小鼠有效。这项研究从民猪肠道中鉴定出一种新型益生菌菌株，提出了一种缓解胃肠道炎症性疾病的新方法。

结果：

表型和功能分析显示，特异性需氧菌和兼性厌氧菌可预防民猪 DSS 诱导的结肠炎的发生                                                                                      

基于民猪对 DSS 诱导的结肠炎表现出更强的抵抗力，作者的研究重点是进行微生物学评估，以查明和验证与 IBD 耐药性相关的关键肠道微生物成分。BugBase 用于预测微生物表型，作者观察到民猪革兰氏阴性菌的丰度显著降低，革兰氏阳性菌的丰度显著增加 （P < 0.05）;这种潜在致病性的降低是显著的 （P < 0.05）。此外，作者的数据表明，两种猪品种中需氧菌和兼性厌氧菌的数量都有所增加 （P < 0.05）。预测显示，民猪和约克夏猪 UC 模型的肠道微生物群具有更大的流动性和更强的生物膜形成能力。进一步的研究表明，Escherichia spp. 在约克夏猪中富集。相比之下，芽孢杆菌属和乳酸菌属在民猪中特异性富集。其中，在相同的炎症免疫刺激条件下，与约克夏猪相比，细菌种类 （L. delbrueckii， L. reuteri， B. siamensis 和 B. subtilis） 被鉴定为民猪的生物标志物物种。这些发现的一个可能解释是厌氧菌的变化。作者的研究结果表明，民猪结肠中富含潜在有益的厌氧微生物，包括Clostridium XVIII、Christensenella 和 Eubacterium。蛋白质组学 KEGG 通路富集分析显示，与约克夏猪 IBD 和促炎通路核因子 κB （NF-κB） 和丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 信号通路] 的显著变化相比，IBD 和相关促炎通路（NF-κB 和 MAPK 信号通路）在闵猪中保持失活。此外，有害细菌感染途径（金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）、Toll 样受体信号通路或 T 没有显著变化H1、TH2 和 TH民猪的 17 细胞分化。约克夏猪的 Toll 样受体信号通路、瞬时受体电位 （TRP） 通道的炎症介质调节、视黄醇代谢或趋化因子信号通路没有显著变化。

在结肠炎模型中从民猪结肠中分离和表征 B. siamensis

使用表型和功能分析，作者分离并选择了具有生物膜形成和对病原菌抗菌活性的需氧菌。分离和鉴定细菌种类的过程如图所示。通过在选择性培养基上培养，作者获得了 96 个纯培养物，并评估了它们抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长的能力。其中 21 种培养物具有抗菌活性，作者选择了最有效的菌株进行进一步鉴定。该菌株名为 MZ16，呈乳白色且不透明，表面折叠，边缘呈圆形/略微不规则. 革兰氏染色显示呈紫色的杆状细胞. 生物膜产生和迁移率元件分析显示，菌株 MZ16 是运动的并形成生物膜。生理测试表明，该菌株可以在 pH 4.0 至 8.0 下生长，耐受 7.5% 的 NaCl，并承受 45 °C 的温度。生化试验显示甲基红和过氧化氢酶试验阳性，吲哚试验阴性。此外，在小鼠进行的 MZ16 体内安全性测试中，观察到规律的喂养和饮水，体重、平均每日采食量和腹泻率没有记录到显著差异。在使用 10 种抗生素的药敏试验中，发现 MZ16 对所有测试的抗生素敏感。作者根据 16S rRNA 序列、菌落形态、生理学和生物化学鉴定了Bacillus siamensis MZ16 细菌。B. siamensis MZ16 的系统发育树如图所示。

B. siamensis 暹罗芽孢杆菌MZ16 改善 DSS 诱导的结肠炎

为了研究 B. siamensis MZ16 对结肠炎的潜在治疗效果，作者使用了 DSS 诱导的结肠炎小鼠模型. DSS 给药导致体重进行性减轻 （P < 0.05）。然而，MZ16 + DSS 组 DSS 诱导的体重减轻显著改善 （P < 0.05）。作者的研究表明，MZ16 + DSS 组的 DAI 显著低于 DSS 组 （P < 0.05）。DSS 组脾脏明显肿大 （P < 0.05）。然而，与 DSS 组相比，MZ16 + DSS 组的脾脏肿大显著减少。DSS 诱导的结肠缩短和结肠密度升高在 MZ16 + DSS 组中也显著改善 （P < 0.05）。苏木精和伊红 （H&E） 染色显示 DSS 组粘膜发生显著的炎症改变，包括隐窝丢失、脓肿形成和炎性细胞浸润。相比之下，与 DSS 组相比，MZ16 + DSS 组的结肠杯状细胞保持相对完整，肠上皮损伤程度较轻。此外，MZ16 + DSS 组表现出粘膜水肿明显减少、溃疡面积减少和出血部位减少，导致组织学损伤评分降低。

B. simensis 介导的 DSS 诱导的结肠炎缓解取决于肠道菌群

在小鼠中，作者通过提前 4 周施用 1 种抗生素混合物来消除肠道微生物群，从而复制了先前概述的实验条件。已知这种方法可诱导结肠炎，类似于在 DSS 诱导的常规小鼠中观察到的。抗生素根除肠道微生物群，如图所示。ABX-DSS 组与 ABX-MZ16 + DSS 组之间的体重减轻显著相似 （P > 0.05）。ABX-DSS 组和 ABX-MZ16 + DSS 组在 4 个激发日的 DAI 评分无显著差异，仅在最后一天观察到显著差异 （P > 0.05）。图 4D 至 F 显示 ABX-DSS 组与 ABX-MZ16 + DSS 组在肝脏系数、脾脏系数或结肠密度方面无显著差异 （P > 0.05）。与 ABX-CON 组相比，ABX-DSS 组出现结肠溃疡、粘膜损伤、杯状细胞丢失和上皮细胞脱落。ABX-MZ16 + DSS 动物还表现出隐窝扩大、破坏和炎性细胞浸润到粘膜和粘膜下层.

B. siamensis 暹罗芽孢杆菌MZ16 部分保护 DSS 诱导的微生物群变化并改变其微生物表型

对常规或微生物群耗尽小鼠的表型临床评估感兴趣，作者研究了微生物群的细菌组成，以评估暹罗芽孢杆菌 MZ16 的疗效。与 DSS 诱导的猪结肠炎一致，DSS 处理显著降低小鼠观察到的 OTU 、 Simpson、Chao1 和 Shannon 指数 （P < 0.05）。然而，与 CON 组相比，MZ16 + DSS 组的微生物物种多样性增加但不显著 （P > 0.05）。主坐标分析 （PcoA） 的结果表明，MZ16 + DSS 组和 DSS 组之间的微生物群落结构存在明显的分离。Bray-Curtis 距离分析用于比较处理组的微生物组成。DSS 处理改变了主要细菌的相对丰度;厚壁菌门的丰度降低，而变形菌门和疣微菌门的丰度增加 （P < 0.05）。然而，在 DSS 给药前用 B. siamensis MZ16 预处理的小鼠在门和属水平上表现出与 CON 组相似的组成结构。DSS 组与 CON 组之间以及 MZ16 + DSS 组与其他组之间观察到显著差异;这些差异包括 DSS 组阿克曼氏菌、埃希氏菌-志贺氏菌和拟杆菌属丰度增加 （P < 0.05） 和韧乳杆菌、真杆菌属和乳酸菌属丰度降低 （P < 0.05）。因此，暹罗芽孢杆菌 MZ16 在 DSS 诱导的结肠炎小鼠中的微生物群改善作用与在 DSS 诱导的结肠炎民猪中观察到的特征相似。

基于猪和小鼠的微生物分析，作者检查了 B. siamensis MZ16 对核心微生物的影响。如图所示，DSS 处理显著降低乳酸菌、克里斯滕斯科 R7、梭状芽胞杆菌、双歧杆菌、唇乳杆菌属和瘤胃球菌等潜在益生菌的丰度 （P < 0.05），而埃希氏菌属和拟杆菌属的丰度显著增加 （P< 0.05）。在 MZ16 + DSS 组中，埃希氏菌-志贺氏菌和拟杆菌等潜在致病菌的丰度降低 （P < 0.05）。此外，作者观察到乳酸菌、Ligilactobacillus、Bacillus、Christensenellaceae R7、瘤胃球菌、梭状芽胞杆菌、真杆菌和丁酸球菌的丰度增加 （P < 0.05）。小鼠的这些功能变化与在猪中观察到的表型变化密切相关。MZ16 + DSS 组与 CON 组细菌表型差异无统计学意义 （P > 0.05）。相比之下，DSS 组肠道中需氧菌的相对丰度略有增加 （0.05 < P < 0.1），这显著增加了兼性厌氧菌的相对丰度 （P < 0.05）。相比之下，MZ16 + DSS 处理显著降低了需氧菌和兼性厌氧菌的相对丰度 （P < 0.05），同时显著提高厌氧菌的相对丰度 （P < 0.05）。作者对核心肠道微生物群进行了网络分析，并揭示了受暹罗芽孢杆菌 MZ16 影响的核心微生物群之间的相互作用。

B. siamensis 暹罗芽孢杆菌MZ16 减轻肠道屏障功能障碍并在非活性状态下维持 MyD88 依赖性通路

为了评估免疫屏障，作者测量了小鼠结肠中的免疫球蛋白 A （IgA） 和分泌型 IgA （SIgA） 水平。DSS 组结肠中 IgA 和 SIgA 浓度显著低于 CON 组 （P < 0.05）。然而，与 CON 组相比，MZ16 + DSS 组结肠中的 IgA 和 SIgA 水平显著恢复 （P < 0.05）。关于机械屏障，作者研究了 B. siamensis MZ16 对 UC 模型小鼠结肠紧密连接 （TJ） 蛋白的影响，特别是 ZO-1 和 OCLN。酶联免疫吸附试验 （ELISA） 结果显示，DSS 组 ZO-1 和 OCLN 表达显著低于 CON 组 （P < 0.05）。然而，MZ16 + DSS 组的 OCLN 水平显著高于 DSS 组 （P < 0.05）。

作者观察到 DSS 组CXCL1 表达增加 （P < 0.05），而这种变化在 MZ16 + DSS 组中是相反的。作者的研究显示 DSS 组髓过氧化物酶 （MPO） 活性增加 （P < 0.05）。然而，CON 组和 MZ16 + DSS 组之间未发现 MPO 活性的显著差异 （P > 0.05）。如图所示，作者的结果显示 TLR4 、 MyD88 、 IKK-α 、 IKK-β 、 NF-κB 、 MAPK 、 JNK （c-Jun N 末端激酶）、TNF-α （肿瘤坏死因子-α）、IL-1β （白细胞介素-1β） 、IL-6 和 IL-17 的表达增加 （P < 0.05）。同样，与 DSS 组相比，MZ16 + DSS 组的 TLR4 、 IKK-β 、 NF-κB 、 MAPK 、 JNK 、 TNF-α 和 IL-6 下调。此外，CON 组和 MZ16 + DSS 组之间未观察到显著差异 （P > 0.05）。如图所示，B. siamensis MZ16 通过调节生物、机械和免疫屏障减轻小鼠结肠炎。

文献来源：Bacillus siamensis Targeted Screening from Highly Colitis-Resistant Pigs Can Alleviate Ulcerative Colitis in Mice. Research (Wash D C). 2024 Jul 16;7:0415. doi: 10.34133/research.0415. PMID: 39015206; PMCID: PMC11249912.(IF:8.5 , 中科院1区).