光免疫疗法攻克顽固生物膜：抑制细菌复苏与预防再感染的研究进展

摘要

顽固性生物膜感染对公共卫生构成严重威胁。临床实践中主要依赖机械清创和抗生素治疗，但这些方法常常失败并导致持续性和复发性感染。主要难点在于：1) 持久性细菌的复苏、定植和生物膜的再生；2) 继发病原体暴露，特别是在慢性病患者中。本文介绍了一种新型光敏剂——聚乙二醇修饰的脂溶性阳离子光敏剂(TBTCP-PEG7)，它在光照射下能有效根除耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。此外，TBTCP-PEG7介导的光动力疗法(PDT)不仅通过下调双组分系统(TCS)、群体感应(QS)和毒力因子来克服顽固性生物膜感染，减少细胞间通信，抑制持久性细菌再生和生物膜重塑，而且通过上调热休克蛋白相关基因来诱导免疫原性细胞死亡(ICD)和建立免疫记忆，从而预防再感染。体内实验表明，TBTCP-PEG7能有效根除附着在医用导管上的MRSA生物膜，刺激血管生成，减少炎症因子表达，并加速伤口愈合。此外，ICD促进短期免疫和长期免疫记忆，以应对次级感染。这种双管齐下的战略不仅有效克服了顽固性、持久性和复发性生物膜感染，而且为设计下一代抗菌材料提供了理论指导。

要点一：免疫原性细胞死亡 (ICD)：ICD 是一种细胞程序性死亡，它能够激活免疫系统，从而预防二次感染。TBTCP-PEG7 的光动力疗法能够诱导 ICD，增强免疫反应，并建立长期免疫记忆。

要点二：光动力免疫疗法：光动力免疫疗法是一种新兴的治疗方法，结合了光动力疗法和免疫疗法的优势。TBTCP-PEG7 通过产生活性氧和诱导 ICD，能有效地清除细菌生物膜并预防二次感染。

方案1. 光动力免疫治疗TBTCP-PEG7治疗复发性生物膜感染的示意图

1. 引言

顽固性生物膜感染是慢性和复发性伤口的主要病原，显著增加了发病率和死亡率。超过65%的人类微生物感染和80%的慢性感染与顽固性生物膜直接相关。生物膜是由细菌在自身产生的胞外多糖基质(EPS)内形成的异质结构，能有效减少抗生素的穿透力并逃避宿主免疫，增加抗生素抗性10-1000倍。生物膜的复发性质常常导致持续性感染，结果导致组织坏死和功能损害，削弱患者免疫系统，使他们更容易受到其他疾病的影响。目前，机械清创和抗生素仍是临床上对抗生物膜感染的主要方法。然而，机械清创的侵入性，以及抗生素抗性的增加和误用抗生素的毒副作用，常常导致治疗失败和多药耐药性的增加。因此，开发新的非抗生素抗菌策略以解决生物膜复发问题是非常必要的。

2. TBTCP-PEG7的设计与合成

本研究中合理设计并开发了一种聚乙二醇功能化的脂溶性阳离子AIE光敏剂，命名为TBTCP-PEG7，用于光动力免疫疗法治疗顽固性生物膜感染。这种光敏剂的设计考虑了以下因素：1) 增强与革兰氏阳性细菌细胞壁的结合能力；2) 提高I型活性氧(ROS)的产生；3) 增加与多糖的结合能力，通过氢键增强对生物膜TCS和QS的抑制效果，预防持久性细菌恢复和生物膜重建；4) 促进ICD发生，快速免疫响应可以阻止病原体传播和严重感染的发生，有效预防二次感染。TBTCP-PEG7的分子结构和光物理性质表明，其在二甲基亚砜(DMSO)中的最大吸收峰为514 nm，在甲苯中的最大发射峰为707 nm，Stokes位移为193 nm，显示出明显的AIE特性。

图 1. TBTCP-PEG7 的分子结构和光物理性质

3. TBTCP-PEG7的ROS生成能力

为了评估TBTCP-PEG7的ROS生成效率，使用2′7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCF-DA作为ROS指示剂。结果显示，TBTCP-PEG7在光照下显著增加了DCF-DA的荧光强度，表明其出色的ROS生成效率。此外，TBTCP-PEG7在光照下显著降低了9,10-蒽双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)的吸收度，显示出优秀的1O2生成性能。同时，TBTCP-PEG7通过I型机制有效生成·OH。

4. 光动力抗菌研究

利用TBTCP-PEG7出色的1O2和·OH生成效率，进一步研究其光动力抗菌效果。结果显示，TBTCP-PEG7在光照下对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)具有显著的抗菌效果，而对革兰氏阴性细菌(G-)的杀伤效果较弱。这表明TBTCP-PEG7能够选择性地结合革兰氏阳性细菌(G+)，减少对哺乳动物细胞的杀伤。

图2. TBTCP-PEG7对革兰氏阳性菌的特异性光动力抗菌活性

5. TBTCP-PEG7的生物相容性

TBTCP-PEG7在人类宫颈癌(HeLa)和人肝癌(HepG2)细胞中的细胞毒性研究表明，TBTCP-PEG7在光照下对这些细胞的存活率影响较小，显示出良好的生物相容性。此外，TBTCP-PEG7在体外实验中显示出对G+细菌的选择性杀伤作用，同时保留了哺乳动物细胞。

6. 光动力根除生物膜

本研究还探讨了TBTCP-PEG7对成熟生物膜的光动力根除效果。结果显示，TBTCP-PEG7在光照下能有效清除S. aureus和MRSA生物膜，而对E. coli生物膜的影响较小。这些结果表明TBTCP-PEG7能够高效地消除耐药性革兰氏阳性生物膜。

图3. TBTCP-PEG7的抗生物膜活性

7. 抑制生物膜复发的体外研究

为了研究TBTCP-PEG7在预防生物膜复发方面的效果，通过3D荧光成像技术观察生物膜的生长状况。结果显示，TBTCP-PEG7+L处理组在培养36小时后，生物膜结构和活菌分布没有明显恢复，而在其他处理组中，生物膜结构和活菌分布显著恢复。这些实验结果明确表明TBTCP-PEG7+L处理显著阻碍了细菌构建生物膜的能力，并且在残留生物膜存在时，TBTCP-PEG7显示出明显的抑制复发生物膜的能力。

图4. 体外抑制生物膜复发

8. 增强抑制生物膜复发的机制研究

为了阐明TBTCP-PEG7增强抑制生物膜复发的机制，进行了转录组分析。结果显示，TBTCP-PEG7+L处理显著改变了MRSA的转录组，下调了与生物膜形成和信号传导相关的基因表达，如clfB、tadA、sdrC、sdrD和sdrE等。此外，TBTCP-PEG7+L处理还下调了与TCS和QS系统相关的基因表达，如hld、oppB、comK、psmB和psmA1_2等，抑制了细菌间的通信，阻碍了生物膜的形成和环境适应性，降低了对宿主的致病性。同时，TBTCP-PEG7+L处理还上调了与氧化应激相关的基因表达，如sqr、ctsR、clpC、clpB、hslU、GRPE、hrcA和HSPD1等，激活热休克蛋白诱导ICD，进一步激活Clp对抗MRSA，有效预防二次感染。

图5. TBTCP-PEG7介导的光动力疗法对MRSA转录组的调控

9. 光动力消除生物膜附着在医疗器械模型上

本研究还探讨了TBTCP-PEG7在体内实验中消除附着在植入医疗器械上的MRSA生物膜的效果。结果显示，TBTCP-PEG7+L处理组在治疗3天后，导管上的MRSA生物膜明显减少，而在其他处理组中，生物膜仍然存在。这些结果表明TBTCP-PEG7+L处理在消除医疗器械上的MRSA生物膜方面具有显著效果。

图7. 组织病理学分析以评估体内光动力抗生物膜

10. 结论

综上所述，本研究成功开发了一种新型光敏剂TBTCP-PEG7，用于对抗顽固性生物膜。TBTCP-PEG7通过光动力疗法不仅能有效根除MRSA生物膜，还能显著抑制生物膜的复发。TBTCP-PEG7通过下调TCS、QS和毒力因子，减少细胞间通信，抑制生物膜形成和环境适应性，降低对宿主的致病性。同时，TBTCP-PEG7上调氧化应激相关基因，激活热休克蛋白诱导ICD，进一步激活Clp对抗MRSA，有效预防二次感染。TBTCP-PEG7在体内外实验中均显示出良好的生物膜清除效果，并能抑制生物膜复发。此外，TBTCP-PEG7介导的光动力免疫疗法通过促进应激相关反应，上调危险信号，诱导更高水平的感染相关ICD，促进树突状细胞成熟，调节巨噬细胞极化，并激活T细胞。这种途径在次级感染小鼠模型中诱导了长期基于B细胞的免疫记忆，对MRSA再入侵产生了显著的预防作用。本研究为抑制持久性细菌复发和预防再感染提供了一种有前景的解决方案，有望解决顽固性生物膜感染并减轻潜在的耐药性问题。

参考文献：J.-L. Wang, X. Pan, X. Li, K.-M. Liu, M. Yao, J.-Y. An, Y. Wan, X.-Q. Yu, S. Feng, M.-Y. Wu, Photoimmunologic Therapy of Stubborn Biofilm via Inhibiting Bacteria Revival and Preventing Reinfection. Adv. Mater. 2024, 2411468.