CIMNE-CRISPR：非洲猪瘟病毒检测的新突破

非洲猪瘟（ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的高度传染性疾病，对全球养猪业造成了巨大的经济损失。ASFV的传播速度快，致死率接近100%，给养猪业带来了巨大的挑战。传统的ASFV检测方法依赖于核酸扩增技术，如qPCR，这些方法虽然灵敏度高，但需要昂贵的设备和专业的操作人员，限制了其在资源有限地区的应用。为了应对这一挑战，加州大学河滨分校的Tathagata Pal、Zilong Liu和Juhong Chen团队开发了一种名为CIMNE-CRISPR的新型无扩增诊断系统，为ASFV的快速早期检测提供了新的解决方案。

CIMNE-CRISPR系统的工作原理

CIMNE-CRISPR系统的核心在于将CRISPR LbCas12a-crRNA复合物共价固定在Fe3O4@SiO2核壳磁性纳米颗粒上。这种设计不仅提高了酶的特异性和稳定性，还通过磁性分离技术实现了目标DNA的富集和背景干扰的去除。具体来说，CRISPR LbCas12a-crRNA复合物能够特异性地识别ASFV的B646L基因，这是一个高度保守的序列，编码对病毒感染至关重要的vp72蛋白。当系统引入到含有目标DNA的样本中时，复合物会选择性地结合到目标序列的PAM位点上。通过磁性分离，富集的复合物被分离出来，非特异性背景成分被去除。然后，将单链DNA荧光探针（ssDNA-FQ）加入到上清液中，LbCas12a在结合目标DNA后被激活，启动探针的转切割，产生与目标DNA浓度成正比的荧光信号。这种无扩增的方法确保了快速、灵敏和特异的ASFV检测。

图1 CIMNE-CRISPR系统检测ASFV的示意图. (a) 展示CIMNE-CRISPR系统制造过程的图表，突出了RNP复合物共价固定在核壳磁性纳米颗粒（MNPs）上的过程。(b) 详细描绘了ASFV目标DNA检测过程，包括RNP介导的目标富集、特异性机制和荧光信号生成。

CIMNE-CRISPR系统的性能评估

图2 CIMNE-CRISPR方法的可行性：(a-b) Fe₃O₄ MNP（核心）和Fe₃O₄@SiO₂核壳MNP的透射电子显微镜（TEM）图像。(c) (i) MNP-NH₂、(ii) MNP-CHO和(iii) MNP-RNP的傅里叶变换红外光谱（FTIR）。(d) 荧光光谱和(e) 强度分析图像，展示了CIMNE-CRISPR系统的可行性。样本集1、2、3和4分别省略了RNP、目标DNA、探针和MNP，而样本集5包含了CIMNE-CRISPR系统的所有组分。误差条表示来自三个生物学重复的标准偏差。注释：RFU：相对荧光单位。

图3  CIMNE-CRISPR系统对ASFV DNA的检测灵敏度。(a) 使用CIMNE-CRISPR系统检测ASFV DNA的详细步骤示意图。(b) 对应于不同DNA浓度（0 - 10¹¹ copies/μL）的荧光光谱。(c) 不同DNA浓度下的荧光强度值，包括动态范围的线性回归（插图），系统检测不同浓度ASFV DNA的荧光图像。注释：RFU，相对荧光单位。NTC，无模板对照。误差条表示来自三个生物学重复的标准偏差。

如上图所示，CIMNE-CRISPR系统的检测限（LOD）为8.1 × 10^4 copies/μL，定量限（LOQ）为4.2 × 10^5 copies/μL，动态范围覆盖10^5到10^10 copies/μL，矩阵因子为100.29%。即使在高突变浓度（10^13 copies/μL）的情况下，该方法也能准确检测到10^5 copies/µL的ASFV DNA。此外，该方法在不同纳米颗粒合成批次中表现出良好的重现性，RSD为9.63%，回收率在97%到103%之间，适合现场诊断。

CIMNE-CRISPR系统的创新点

共价固定：CRISPR LbCas12a-crRNA复合物通过共价键固定在磁性纳米颗粒上，显著提高了酶的稳定性和特异性，减少了背景干扰。

磁性富集：利用磁性纳米颗粒的特性，实现了目标DNA的高效富集和背景干扰的去除，提高了检测的灵敏度和特异性。

无扩增检测：无需复杂的核酸扩增步骤，简化了检测流程，降低了成本，适合资源有限地区的应用。

高特异性：即使在高突变浓度的情况下，也能准确检测到目标DNA，显示出极高的特异性。

未来展望

CIMNE-CRISPR系统不仅为ASFV的检测提供了一种新的高效、低成本的方法，还为其他病毒和细菌的检测提供了新的思路。未来的研究方向包括进一步提高检测的灵敏度，实现多靶标的检测，以及开发便携式检测设备，实现现场快速诊断。通过这些努力，CIMNE-CRISPR系统有望在农业、环境和人畜共患病检测中发挥更大的作用，为全球公共卫生和食品安全提供有力支持。

文章来源： https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117154.