AFM | 高压二氧化碳技术：打造病毒仿生鲜花点阵

自然界中的许多材料都具有复杂的层次化结构，这些结构在宏观、微观和纳米尺度上展现出独特的功能和性能。受此启发，研究人员现已开发了多种具有分层结构的仿生材料，应用于组织工程、生物传感及生物污染防治领域，不过都局限在1-2级结构。此外，现有的结构通常通过热诱导收缩、溶剂诱导收缩和机械拉伸/释放实现，这些方法在实际应用中面临诸多挑战。例如，高温和化学试剂会使蛋白质和生物纳米颗粒变性，而物理拉伸/释放通常只适用于特定的基底-涂层组合，难以集成到高精度的微打印系统中。因此，开发一种能够保留生物分子纳米结构的通用方法是当前研究的一个重要方向。病毒纳米颗粒，如噬菌体（细菌病毒），具有一些工程纳米颗粒无法比拟的优越特性，例如单分散自复制、形状和大小的多样性，以及通过化学或基因修饰对表面化学的精确控制。这些特性使噬菌体成为构建下一代生物模拟材料的强大天然构建块。基于此背景，东南大学田磊研究员提出了一种无热、无溶剂的基底收缩方法——高压二氧化碳（HPCD）技术，并利用此技术在聚苯乙烯（PPS）软材料上制作出可调控的3D多尺度皱纹形态的噬菌体微点阵列。此阵列具有四级层次结构，分别为：①微点阵列，200-600微米宽。这是整个微阵列的基础结构，由多个微点组成。每个微点是一个独立的噬菌体凝胶网络，通过喷墨打印技术精确地打印在预拉伸的PPS基底上。②微尺度褶皱，0.7-5.0微米宽。在HPCD处理后，PPS基底均匀收缩诱导微点表面收缩形成皱褶，表现为微点中心区域的高度折叠和边缘区域的放射状皱纹。③亚微米束，100纳米宽。在微点内部，噬菌体纳米纤维（7纳米宽）自组装成有序排列的亚微米束。④噬菌体纳米纤维，7纳米宽，这是微阵列的最基础结构（图1）。

基于所构建的3D噬菌体微点仿生阵列，作者引入RNA裂解荧光DNA酶（RFDs）以评价阵列的实用性。在这里，通过构建三组实验突出褶皱结构的优势性：①平面二维RFD阵列；②平面二维噬菌体-RFD；③3D噬菌体微点仿生阵列。首先，褶皱结构具有增强荧光强度的效能：平面噬菌体-RFD微点阵列的荧光信号比平面二维RFD阵列高出264.9%，3D噬菌体微点仿生阵列的荧光信号进一步增加了101.2%。此增强效果可解释为：褶皱结构显著增加了微点的表面积，继而为RFDs提供了更多的结合位点。其次，褶皱结构对生物分子的固定效果和稳定性。通过模拟微阵列在实际应用中可能遇到的环境条件，如长时间的液体接触、震荡，对上述3种微点阵列荧光信号进行检测。结果显示，在24小时洗涤后，平面二维RFD阵列的荧光信号损失超过56.0%（大量RFDs被洗脱）；平面噬菌体-RFD微点阵列的荧光信号损失为17.2%（较为稳定）；3D噬菌体微点仿生阵列的荧光信号损失仅为4.0%（最为稳定），由此展示了3D褶皱结构增强了RFDs的固定稳定性。进一步，作者利用不同浓度的嗜肺军团菌培养液（10⁵到10⁸ CFU/mL）提取的粗提取液验证了方法的检测性能。结果显示，相对于平面噬菌体-RFD微点（对照组），所构建的3D噬菌体微点仿生阵列可将检测限提升2个数量级：10⁵ CFU/mL。另外，通过检测来自工业冷却塔的3例受污染水样，验证了这种仿生阵列在实际环境中的应用潜力：针对嗜肺军团菌的检测结果与传统培养法完全一致（图2）。

总之，本研究开创性地提出了一种无热、无溶剂的通用基底收缩方法——HPCD，通过此方法可以保留生物分子的纳米结构和生物活性，形成可调控的3D褶皱结构，并将其应用于生物传感领域，显著提高了检测灵敏度和稳定性。值得强调的是，研究所构建的具有四级层次结构的生物材料，既能保留生物分子的纳米结构，还能保护加载到微阵列中的生物识别分子的活性，这是现有的基于热或溶剂的收缩方法无法实现的结果。另外，本研究的成果“噬菌体微米级仿生鲜花”入选了学术权威期刊《自然》的“2024年度最佳科学图片”，凸显了本研究的突破性。不过，文章也有某些地方尚待提升，譬如，嗜肺军团菌的检测需要提前24 h的共孵育，这在检测领域内并不具备时间优势。未来的研究可以探索进一步缩短检测时间的方法，以提高该技术在实际应用中的效率。

图1  HPCD处理后的噬菌体凝胶微点阵列的四级层次结构。（a）噬菌体微点阵列从微观到纳米尺度的四级层次结构。（b）微点表面在形成微尺度皱纹前后的3D原子力显微镜（AFM）图像。（c）噬菌体纳米纤维自组装形成的亚微米束的有序排列。（d）噬菌体纳米纤维的自组装。1）微点皱褶的AFM图像。2）亚微米束结构的AFM图像。3）AFM图像显示的噬菌体排列示意图。4）2）中箭头方向的束的表面粗糙度轮廓。

图2  噬菌体微阵列在加载RFDs后的生物传感性能。（a）噬菌体微点阵列加载生物识别分子（抗体和DNA酶）后在HPCD处理后的荧光检测示意图。（b）平面二维噬菌体-RFD的荧光信号与经HPCD处理后的皱纹微点的荧光信号比较。（c）应用噬菌体-RFD微点阵列检测嗜肺军团菌的过程示意图。（d）一个噬菌体-RFD微点的扫描电镜图像（50μm）和更高放大倍率的表面形态图（10μm）。（e）6个噬菌体-RFD微点的荧光强度。（f）平面二维噬菌体-RFD和3D噬菌体微点仿生阵列相对于平面二维RFD微点阵列的初始荧光强度比较。（g）缓冲液洗涤后，（f）中的三种阵列的荧光信号比较。（h）3D噬菌体微点仿生阵列与平面二维噬菌体-RFD微点阵列的检测灵敏度比较。（i）褶皱噬菌体-RFD微点阵列针对3份冷却水塔水样的检测结果。

原文DOI: 10.1002/adfm.202414375