使用磁性聚二乙炔纳米颗粒比色检测小鼠尿液中HER2过度表达的癌症衍生外泌体

1. 引言

乳腺癌（BC）是全球发病率最高的癌症，2022年女性乳腺癌病例超过肺癌，成为主要癌症原因，占所有癌症病例的11.7%。约20-25%的乳腺癌患者存在HER2过表达，这与更高的攻击性和死亡率相关。虽然抗HER2药物如曲妥珠单抗显著提高了早期患者的生存率，但在低收入国家，乳腺癌死亡率仍然较高，因此迫切需要开发简单、低成本的诊断平台。外泌体作为液体活检中的生物标志物，因其在多种体液中的稳定性而受到关注。然而，肿瘤来源的外泌体在体液中含量微小，需有效分离和浓缩。现有的分离方法如超离心存在局限性，且常用的检测方法复杂，不适合资源有限的地区。因此，研究者探索基于金纳米粒子和聚二乙炔（PDA）的比色检测策略，以提供一种简便、低成本的外泌体检测方法，适用于中低收入国家。PDA在外界刺激下能引起颜色变化，为液体活检提供了新的可能性。

本研究开发了一种能够视觉检测HER2过表达外泌体的比色传感器，使用二肉豆烯酰基磷脂酰胆碱(PCDA)/1,2-二肉豆烯酰基- n-甘油-3-磷脂胆碱（DMPC）纳米颗粒结合HER2抗体和亲水性磁性纳米颗粒（hMNPs） （HER2- mpda）（方案1A）。这种比色传感器是一种新概念传感器，它增加了现有传感器的功能和分离目标的能力。本研究开发的MPDA传感器可以通过比色变化识别目标外泌体，然后使用磁铁稳定地分离它们。通过使用过表达HER2的外泌体证实了该传感器的性能。使用过表达her2的癌细胞和过表达her2的BC小鼠模型的尿液培养基（方案1B）检测HER2-MPDA。

方案1. 使用磁性响应性聚二乙炔（PDA）纳米颗粒（NP）比色检测尿液中HER2-过表达的癌症衍生外泌体。A）HER2-MPDA合成示意图，一种用于检测HER2过表达外泌体的比色传感器。B）使用HER2-MPDA在未纯化的尿液样本中比色检测HER2过表达外泌体的示意图。

2. 结果与讨论

MPDA的制备及特性

MPDA是一种混合材料，结合了PCDA/DMPC纳米颗粒和亲水性磁性纳米颗粒（hMNPs），用于检测基于比色变化的外部刺激。PCDA/DMPC纳米颗粒通过薄膜水化法制备，并在254 nm紫外光照射下诱导聚合，形成蓝色颗粒。经过热刺激后，颜色变化为红色，且与未添加DMPC的PCDA纳米颗粒相比，颜色变化更显著。

hMNPs通过还原氯化铁合成，并与PCDA/DMPC纳米颗粒在酸性条件下反应，形成MPDA。FT-IR分析确认了羧基与羟基之间的氢键形成。透射电子显微镜（TEM）显示PCDA/DMPC纳米颗粒和hMNPs的形态，能量色散X射线光谱（EDS）分析表明hMNPs与PCDA/DMPC纳米颗粒良好结合。

MPDA的水动力直径约为153 nm，尽管hMNPs的存在略微降低了其磁化值，但仍保持超顺磁性。比色响应实验表明，MPDA在外部刺激下能够有效变化颜色，且在两周内保持稳定性和无团聚现象。

图1. MPDA的特点。A）PCDA/DMPC纳米颗粒（NP）、B）亲水性磁性NP（hMNP）和C）与PCDA/D-PCNP（MPDA）复合的hMNP的透射电子显微镜（TEM）图像。D）MPDA的能量色散X射线光谱（EDS）。E） 每个颗粒的流体动力学尺寸分布。F）使用VSM测量MPDA和hMNP的磁化。G）MPDA的吸收光谱变化（紫外线照射前后和70℃热刺激30分钟后）。H）MPDA在磁场中的行为（紫外线照射（i）和热刺激（ii）后）。

MPDA的色性

研究评估了MPDA作为比色传感器在不同温度和pH条件下的稳定性。MPDA在室温或接近体温时稳定，颜色在40°C以下保持蓝色，温度升高时逐渐变为红色。比色响应在40°C以下小于10%。在不同pH条件下，MPDA在酸性和中性环境中表现出良好的稳定性，但在碱性条件（pH > 10）下则显著变化。在尿液和血液的pH范围内（4.5-8.0），MPDA的颜色变化不明显，表明其适合用于体液检测。

图2. MPDA在不同温度（25-70℃）和pH（2-14）条件下的稳定性。MPDA在不同温度（A、B）和pH值（C、D）下的比色变化和吸光度谱移。

利用HER2-MPDA比色法检测her2过表达癌源外泌体

研究首先培养了HER2过表达的HCC1954和HCC1143细胞，分离其外泌体并进行表征。HCC1954外泌体呈球形，平均浓度为6×10¹⁰颗粒/mL，流体动力学直径分别为87.2±2.8 nm和75.5±1.1 nm。通过检测CD63和Tsg101等蛋白标记，确认HCC1954外泌体中表达HER2。为了特异性检测HER2过表达外泌体，研究将HER2抗体偶联到MPDA上制备HER2-MPDA。实验结果显示，只有HCC1954外泌体在HER2-MPDA溶液中呈现红色，而其他样本保持蓝色，这表明了抗原-抗体的特异性结合。吸光度分析显示，HER2-MPDA能够有效检测HER2过表达的外泌体，并在未纯化的细胞培养基中成功分离和检测到HER2和CD63蛋白。

图3. HER2-MPDA检测HER2过表达外泌体的特异性。A）HCC1954外泌体的TEM图像。B）使用纳米追踪分析仪（NTA）测量HCC1954和HCC1143外泌体的流体动力学直径。C）HCC1954和HCC1143外泌体中HER2和外泌体蛋白标志物（CD63、CD9、TSG101）的蛋白质印迹分析。D）HER2-MPDA的彩色图像，E）它们的吸收光谱，F）外泌体（HCC1954和HCC1143外泌体）和蛋白质（牛血清白蛋白；BSA，人免疫球蛋白G:IgG和纤维蛋白原：FB）检测后的比色反应（%）。G）使用HER2-MPDA和H）蛋白质印迹分析分离的外泌体中的蛋白质标记物，说明从HCC1954细胞培养基中分离外泌体的方法。

评估了HER2-MPDA在不同浓度HCC1954外泌体中的检测灵敏度。随着外泌体浓度增加，HER2-MPDA的颜色由蓝色变为红色，特别是在浓度超过1×10¹⁰颗粒/mL时，观察到明显的比色变化和吸收光谱蓝移。比色响应与外泌体浓度呈线性关系，检出限（LOD）为8.5×10⁸颗粒/mL。非线性回归分析表明，比色反应随外泌体数量增加而增强，验证了HER2-MPDA在检测HER2过表达外泌体中的定量和定性能力。该传感器的灵敏度和检测时间与现有方法相比表现良好，适合中低收入国家的无创外泌体检测。

图4. 基于HER2-MPDA比色变化的her2过表达外泌体定量。A)图像显示不同her2过表达外泌体浓度下HER2-MPDA的比色变化。B) HER2-MPDA吸光度谱随外泌体浓度变化。C) HER2-MPDA根据过表达her2的外泌体浓度的比色反应（%）。D) (C)中红色方格区域过表达her2的外泌体浓度与其比色响应（%）的关系

使用HER2- mpda比色法检测HER2过表达BC小鼠（HER2(+) BC）模型尿液中HER2过表达外泌体

为评估HER2-MPDA作为比色传感器在HER2(+)乳腺癌小鼠尿液中检测外泌体的能力。每只小鼠注射6×10⁶个HCC1954细胞以建立HER2(+) BC模型，监测肿瘤体积。当肿瘤体积超过150 mm³时，确认其为HER2(+) BC。通过qRT-PCR比较HER2(+) BC和健康小鼠尿液样本中HER2的表达，结果显示HER2(+) BC小鼠的表达量约为健康小鼠的16.45倍。使用HER2-MPDA检测尿液样本中的外泌体，发现经过磁分离后，HER2-MPDA在HER2(+) BC样本中变为红色，而健康样本保持蓝色。再分散在PBS中后，清晰的颜色差异进一步确认了检测结果。此外，HER2(+) BC样本的比色反应显著高于健康样本，表明HER2-MPDA能够特异性检测HER2过表达的外泌体。

图5. HER2-MPDA作为小鼠尿液样本中HER2过表达外泌体传感器的性能。A）使用HER2-MPDA对小鼠尿液中HER2过表达外泌体进行比色检测和磁分离。B）健康小鼠和HER2过表达乳腺癌症小鼠的图像（黄色：HCC1954细胞注射部位）。C）HER2-MPDA与尿液样本反应的图像，在尿液中磁分离前后（i）以及在PBS中重新分散后磁分离前后的图像（ii）。D）根据小鼠模型，HER2-MPDA吸收光谱的变化。E）健康和HER2（+）BC小鼠尿液中HER2-MPDA的比色反应（%）。F）HER2-MPDA检测到的外泌体中蛋白质标记的蛋白质印迹分析。

3. 总结

HER2-MPDA是一种用于视觉检测HER2过表达癌源外泌体的比色传感器，基于PCDA/DMPC纳米颗粒与亲水性磁性纳米颗粒（hMNPs）结合HER2抗体。该传感器结合了PDA的色度特性和hMNPs的磁性，能够特异性识别HER2过表达的外泌体，导致颜色变化，从而实现直观检测。此外，hMNPs有助于通过磁分离有效检测低浓度外泌体。使用过表达HER2的癌细胞和BC小鼠模型的尿液培养基验证了传感器性能。结果显示，HER2-MPDA对过表达HER2的外泌体颜色由蓝色变为红色，而健康小鼠尿液中未见颜色变化。这表明HER2-MPDA作为液体活检传感器具有即时诊断HER2过表达乳腺癌的潜力，易于非专家使用，并可扩展到其他癌症或疾病的诊断。

论文链接：https://doi.org/10.1002/smll.202307262