无需PAM的核酸外切酶辅助Cas12a检测法可直观检测弧菌

全球变暖导致水中致病菌种群数量激增，据估计，每年对美国造成的经济影响达70亿美元。在全世界的食源性致病菌中，副溶血性弧菌是最常见的一种，可引起急性胃肠炎及其并发症，而霍乱弧菌是该属中另一种重要的致病菌，是霍乱的病原体。这些物种的强毒株可通过特定的遗传标记来识别：副溶血性弧菌的耐热直接溶血素(thermostable direct hemolysin, TDH)和霍乱弧菌的霍乱毒素基因(cholera toxin genes, ctxA)。贝类的滤食行为可使细菌在组织内浓缩100倍，因此食用贝类是造成弧菌感染的主要原因。因此，迫切需要对食源性致病菌进行检测。目前的商业检测方法包括定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)试剂盒和基于生化的方法，例如发酵和选择性琼脂，用于可视化菌落形态和比色显示，这些方法需要仪器和专业知识。现场检测试剂盒将有利于牡蛎养殖户和餐馆进行质量控制。

成簇的规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)相关酶，尤其是Cas12和Cas13家族中的酶，可在无需仪器的现场应用中实现高度特异性和灵敏的核酸检测。CRISPR-Cas酶在37℃下运行，并在CRISPR RNA(crRNA)杂交识别核酸后被激活，从而激活非特异性单链DNA(single-stranded DNA, ssDNA)反式切割活性，通过荧光团猝灭剂(fluorophore-quencher, ssDNA-FQ)报告基因的切割可视化。CRISPR检测通常与指数核酸扩增方法配对，包括PCR或等温扩增方法，如重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)和环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)。

使用扩增试验作为唯一检测方法可能会产生假阳性结果，而加入CRISPR-Cas酶可增强检测的特异性。基于CRISPR的检测已被证明能够成功实现对病毒、细菌种类和通过适体偶联的各种分子的灵敏检测。不同的CRISPR-Cas系统表现出正交活性，从而能够实现具有不同靶标特异性的多路复用检测策略。例如，结合Cas12a和Cas13可以在单个反应中同时检测DNA和RNA靶标。当与横向流动试纸条技术结合时，这些系统可以实现快速、现场可部署的诊断。

传统的基于Cas12a的检测依赖于对双链DNA(double-stranded DNA, dsDNA)模板中特定的原间隔区相邻基序(protospacer adjacent motif, PAM)的识别，通常是TTTV序列（其中V代表A、C或G）。与PAM序列结合后，Cas12a蛋白会在目标位点解开dsDNA，从而实现crRNA杂交和Cas12a激活。然而，在检测靶标的保守区域中，PAM位点可能稀少或缺失，这大大限制了设计稳健crRNA的选择。因此，研究人员通过两种主要方法研究了各种策略来消除PAM位点限制并提高通用性：酶工程和直系同源物探索。这些策略导致了Cas酶变体的发现和定向进化，例如SpRY、LbABE8e和LtCas12a，它们可以识别不同的PAM位点。或者，一些方法采用具有增强错配耐受性的Cas变体来适应非保守位点中的序列变异。这些进展大大扩展了可用于检测和基因工程应用的位点。

目前已经开发了几种无PAM检测方法，但它们的实际应用仍然有限。LAMP等温扩增需要较高的激活温度(60–65℃)，因此不适合现场检测。立足点系统需要复杂的设计和仪器。其他无PAM策略包括迭代crRNA引物设计、粘端dsDNA、级联链置换和Cas9切口酶辅助ssDNA生成。此外，这些策略通常需要复杂的设计考虑，往往缺乏普遍适用性，并且可能难以针对不同的目标序列进行优化。

AIOD-CRISPR展示了一种有前途的方法，即利用RPA链置换重组酶产生的ssDNA来激活Cas12a。虽然该系统确立了ssDNA作为快速、特异性和灵敏检测的有效Cas12a激活剂的地位，但它面临着巨大的局限性。尽管经过了严格的优化，但由于RPA缓冲液成分的抑制，AIOD-CRISPR需要高浓度的Cas12a酶。据报道，高浓度的Cas12a会导致高背景信号，从而减少crRNA激活所需的最小碱基对数，并使检测成本增加数倍，从而阻碍了食品工业和餐馆的商业使用。

近日，香港大学理学院生物科学学部Jiangwen Zhang团队在Sensors and Actuators: B. Chemical期刊上发表了题为：Exonuclease-assisted Cas12a assay without PAM requirement for visual detection of vibrio species论文。

为解决上述问题，本研究开发了一种无PAM的核酸外切酶辅助Cas12a核酸检测(PAM-less Exonuclease-assisted Cas12a Nucleic-acid Detection, PECAN)系统。该方法利用T7核酸外切酶(T7 exonuclease, T7exo)，这是一种5′到3′DNA核酸外切酶，它使用硫代磷酸酯保护的引物从dsDNA RPA扩增子生成ssDNA。所得的ssDNA可作为模板，通过直接crRNA与ssDNA靶标杂交来激活PAM独立的Cas12a。该研究提出了一种优化的RPA-Cas12a-T7exo系统，用于灵敏地检测弧菌种。此外，还用lambda核酸外切酶或PCR扩增子测试了PECAN，以证明该系统的多功能性。

为了在没有PAM的情况下利用Cas12a介导的激活，应首先消化dsDNA以形成包含与crRNA互补序列的ssDNA模板。尽管其他核酸外切酶可以从dsDNA模板生成ssDNA，但由于难以确定要降解哪条链，因此未考虑3'至5'核酸外切酶。不表现出未标记ssDNA消化活性的5'至3'核酸外切酶包括Lambda核酸外切酶、核酸外切酶VIII和T7exo。核酸外切酶VIII不能被硫代磷酸酯键抑制，也不会偏好dsDNA中的磷酸化链，这使其不适合用于测定。T7exo具有从dsDNA高效生成ssDNA的能力，这一点已得到充分证实，因此对T7exo进行了测试和优化，以构建PECAN系统。通过将引物5’端5-6 nt的DNA磷酸二酯键替换为硫代磷酸酯键，可以阻断目标链的消化。因此，T7exo只会消化互补链，从而暴露模板链上的crRNA结合位点（图1a）。

仅当所有成分都存在时才观察到荧光，对照中未观察到荧光（图1b），表明PECAN成分在一锅反应中协同作用。使用在TDH1 crRNA之前添加的含有TTTA PAM位点的质粒，可以在没有T7exo的情况下观察到Cas12a的激活，但在没有PAM位点的模板中则观察不到。然而，添加T7exo后，无论有没有PAM位点的模板都可以观察到荧光，表明T7exo在PECAN中起着核心作用。由于链置换，RPA反应中自然会产生少量ssDNA，“无T7exo”对照中荧光较弱。结果表明，T7exo可以有效生成用于无PAM激活Cas12a的ssDNA模板。

图1 PECAN检测的设计和工作原理。a.PECAN系统示意图。Cas12a-crRNA复合物与目标硫代磷酸酯保护链互补，十字表示没有PAM位点介导气泡的杂交阻断。b.在蓝光或紫外光下评估20 min终点的五种不同PECAN反应。反应在“混合”缓冲液（0.5×NEB2.1+0.5×NEB4）中进行，最终DTT浓度为1.5 mM。含有TDH和ctxA基因序列的质粒（3×10³ bp，8 fg，0.6 pM）用于10 µL RPA反应，其中将0.5 µL RPA反应加入PECAN混合物中。

crRNA位于基因组中不太可能发生突变的保守区域，可以防止出现假阴性读数。首先，确定一个致病标记，即副溶血性弧菌的TDH，然后进行多序列比对以识别具有序列共识的区域。然后可以在保守区域上设计crRNA（图2a）。尽管RPA引物对单碱基对错配的耐受性更高，但它们仍应位于保守区域，以尽量减少使用简并引物并防止出现假阴性结果。在引物的5’端添加了6 nt硫代磷酸位点修饰。图2中使用的crRNA TDH1是正向crRNA，靶位点用反向引物扩增；因此，在反向引物硫代磷酸保护下，PECAN效率较高。使用无保护的引物时，T7exo产生的ssDNA可能会重新杂交，从而导致另一轮降解。但如果模板与可用的Cas12a相比过量，则可以使用无保护的引物作为替代方案。如在同时具有无保护的正向和反向引物（FP和RP）的组中所示，仍然可以观察到荧光，尽管强度较低（图2d）。对于具有硫代磷酸保护的正向引物的扩增子，扩增子的反向链会被消化，导致crRNA杂交位点的丢失；对于正向和反向引物均受保护的扩增子，两侧均会抵抗T7exo消化，因此在两种情况下都观察到低信号（图2b），因为靶链未暴露以触发crRNA杂交。与设计一致，只有反向引物受保护的扩增子才具有强信号，因为反向靶链暴露于正向crRNA。这表明PECAN在正确的crRNA和硫代磷酸酯引物组合下是有效的。

图2 用于PECAN检测的crRNA和引物设计示例。a.工作流程识别适合crRNA和引物设计的保守区域。b.在不同引物上加入硫代磷酸酯保护会导致PECAN的不同结果。c.使用不同组合的受保护RPA引物对TDH进行20 min PECAN的荧光测量。d.使用不同组合的受保护RPA引物对TDH进行20 min PECAN的紫外视图，以及crRNA TDH1。使用含有TDH基因的质粒作为模板。

研究人员接下来进行了T7exo和Cas12a针对PECAN的优化。NEB推荐对EnGen Lba Cas12a使用NEB r2.1缓冲液，对T7exo使用NEB4缓冲液。为了初步筛选最适合一锅系统T7exo和Cas12a活性的缓冲液，用不同的DTT和Mg²⁺浓度测试了各种缓冲液，包括NEB r2.1、Mix（0.5×NEB r2.1+0.5×NEB4）和NEB4。比较NEB4或Mix中的T7exo，尽管Mix中的DTT浓度较低，但Mix中的T7exo活性增强。加入DTT至最终浓度为1 mM，T7exo活性进一步增强。然而，当Mg²⁺浓度达到20 mM时，添加MgCl₂会抑制T7exo活性（图3a）。这表明添加DTT为T7exo的活性提供了良好的还原环境。在Mix缓冲液中将DTT浓度从1 mM进一步增加到40 mM并没有进一步增强T7exo活性（图3c）。

对于Cas12a，与NEB r2.1相比，发现Cas12a在NEB4和Mix中保持了切割活性（图3b）。添加DTT至1 mM不会显著提高Cas12a活性；然而，添加10 mM DTT后，Cas12a反式切割活性增加（图3b、d）。研究还表明，将镁浓度提高至20 mM并添加DTT可以增强Cas12a的反式切割活性。然而，由于添加的镁会抑制Mix和Mix+DTT中的T7exo活性（图3a），因此一锅法Cas12a-T7exo的最佳缓冲液是Mix+DTT。如果某个crRNA表现出较高的Cas12a背景，则可以使用不添加DTT的简单Mix缓冲液。

对于Cas12a与crRNA的复合，发现Cas12a与crRNA的比例为1:2时，与1:1时相比，其反式切割活性更高（图3e）。crRNA TDH1和TDH2结合时，在最终crRNA浓度相同的情况下产生更高的荧光，这可能是由于每条ssDNA模板链上可用的crRNA结合位点增加了一倍。双crRNA的改善似乎取决于溶液中可用模板与总Cas12a的比例。减少PECAN中的T7exo量（图3g）未显示荧光的显著差异。

图3 T7exo和Cas12a一锅系统的优化。a.使用各种缓冲条件、DTT和Mg²⁺浓度的T7exo缓冲液优化（补充图4）。b.使用各种缓冲条件、DTT和Mg²⁺浓度的Cas12a缓冲液优化。c.T7exoDTT优化高于1 mM。d.以10×mol ssDNA为模板的Cas12a DTT优化。e.在10 min RT Cas12a crRNA偶联后，观察到不同Cas12a与crRNA比率的反式切割活性。f.针对Cas12a反式切割的ssDNA-FQ浓度优化。g.PECAN T7exo量优化。h.PECAN的推荐试剂浓度、缓冲液组成和模板比例。b、d、e、f使用0.1 µM Cas12a、0.2µM crRNA TDH1和1 µM ssDNA模板。1单位T7exo与100 ng TDH扩增子在10 µL反应中用于a、c，孵育20 min。误差线表示重复的平均值±S.E.M。使用单因素方差分析分析b、d、f、g的统计显著性。使用非配对双尾t检验分析e的统计显著性。

为了说明RPA-PECAN的特异性，以100 ng粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌基因组DNA作为非特异性测试，以1 ng弧菌基因组DNA作为靶标进行了检测（图4a、b）。发现对照组和无模板对照具有阴性信号，而弧菌样品显示阳性检测结果。结果表明RPA-PECAN中RPA和Cas12a的双重特异性有效抑制了非特异性信号。在对应于1:100目标与非特异性基因组比例的混合基因组组中观察到减弱的荧光信号，在100个6 Mbp非特异性基因组DNA拷贝中检测到一个100 bp目标扩增子的拷贝，表明该检测方法对于检测存在无关细菌DNA的致病弧菌是稳健而准确的。可以进行弧菌的APW和TCBS肉汤富集以产生更强的检测信号。为了进一步评估该检测的稳健性，使用副溶血性弧菌基因组DNA来测试检测限（图4c）。使用透照仪的ssDNA-FQ报告基因，检测限低至15份。对于稳健的信号，侧流试纸的检测限为1.5×10⁴份基因组DNA，这与之前的报告一致，表明与基于荧光的方法相比，侧流检测的分析灵敏度较低。因此，侧流试纸更适合预富集样品，而荧光报告基因可为直接样品分析提供更高的灵敏度。

为了能够高效地检测拭子或食物样本中的弧菌种，研究人员开发了一种快速的纸基基因组DNA分离方法。利用该方法检测了从超市购买的牡蛎样本中的TDH阳性副溶血性弧菌（图4e）。纸浸法依赖于基因组DNA对纤维素的亲和力，然后在TE缓冲液中进行简单清洗，并直接洗脱到RPA反应混合物中。将直接洗脱与将滤纸留在RPA反应中进行了比较，发现滤纸的存在会抑制目标扩增。该方法能够快速、无需离心地分离DNA以进行下游检测。

通过将ssDNA-FQ报告基因更改为ssDNA-FAM-biotin，可以实现横向流动分析，这允许用户在没有蓝光透射仪的情况下可视化Cas12a反式切割活性（图4c）。为了实现更灵敏的检测，可以用橙色玻璃纸和蓝光LED以低成本制作简单的蓝光照明器。为了在没有热循环仪或电子加热器的情况下进行无仪器检测，研究人员开发了一种原型3D打印盒，可与醋酸钠加热包一起使用以保持最佳反应温度，从而能够在大约60 min内进行快速目视检测。

图4 PECAN检测和无仪器即时诊断(POC)的特异性。a.荧光值和b.使用1 ng弧菌基因组DNA（TDH和vcgC阳性）进行TDHRPA-PECAN检测的目视检测。100 ng大肠杆菌(DH5α)基因组DNA用于特异性检测。c.使用ssDNA-FAM-生物素报告基因对PECAN TDH和ctxA进行横向流动分析，质粒模板有3×10³份。d.从不同数量的弧菌基因组DNA中读出的信号。e.使用原型3D打印盒对从超市购买的牡蛎样本中的弧菌进行无仪器检测。

综上所述，PECAN系统能够针对没有PAM位点的位点进行crRNA设计。鉴于序列比对揭示了许多病原体基因组中有限的保守区域，该系统显著扩展了基于Cas12a的核酸检测的多功能性。通过外切酶掺入和缓冲液优化，改进了以前的系统，开发了一种经济高效且简化的快速检测弧菌DNA的方法。此外，该技术的功能无需复杂的仪器即可实现现场应用，凸显了其广泛的实用性。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.snb.2024.137044