用于微生物检测的生物发光芯片

世界卫生组织表明，由沙门氏菌、李斯特菌、梭状芽孢杆菌和大肠杆菌引起的食源性疾病（FBD）严重危险公众健康和生命。因此，病原微生物的检测及其污染水平的评估对于食品安全至关重要。目前量化微生物污染水平的方法有两种：一种是传统的培养法，包括培养分离、血清分型等，通常需要5-14天，较为耗时；另一种是较为有效和方便的检测技术，如免疫测定法、核酸分析、基于腺苷-5′-三磷酸（ATP）的化学发光技术，其中基于ATP的生物发光技术因其具有的灵敏度和准确度成为确保食品安全的重要工具。然而基于ATP的生物发光分析缺乏检测特异性，不能区分病原微生物类型，造成该项技术无法普及和商业化应用。为了解决现有生物发光检测方法的不足，Reza Abbasi等人将注意力转向了芯片上、无透镜显微镜的传感器技术，并结合微流控系统和电化学发光（ECL）系统的集成，成功开发出紧凑型ECL生物传感器，能够在单一平台上同时处理样品和收集数据。与以往的研究相比，本次研究提高光子收集效率和灵敏度，同时保持生物传感设备的低成本和便携性，采用以下两种新的改进方案：

（1）通过移除红外滤光片和镜头，使样品到传感器表面的距离最小，提高光子收集效率。

（2）使用不透明的PDMS材料制造了样品架，通过切割压敏双面胶带以匹配微流控通道的尺寸，使用掩膜对准器(OAI Model 200)将不透明白色的PDMS器件精准对接到CMOS传感器。不透明的PDMS可以防止CL信号的反射，提高了信号与背景的比率。

此外，为了评估CMOS传感器的性能，研究首先检测了该器件的灵敏度和检测限，进行了CMOS器件、发光计和平板阅读器在不同缓冲液（Invitgen Buffer和UltraSnap Buffer）中检测ATP的的分析性能和比较。随后，为了研究制造过程的重现性和实用性，检查了不同设备在UltraSnap缓冲液中分别检测1μM三磷酸腺苷的能力。紧接着，研究评估了该器件与商业发光计的性能对比分析，使用这两种设备测量了不同浓度的添加的ATP溶液。最后，采用实际样品进行检测，将CMOS传感器和EnSURE光度计均用于测量多种常见表面如电梯按钮、手机、快餐桌、钱包等的ATP污染情况。研究结果显示：

①该传感器的空间分辨率为1.4μm，图像传感器的视场为7.07 mm²，具备了较高的分辨率和光子收集能力；

②性能检测结果显示，ATP浓度的增加与CL信号的强度呈正相关，这说明该传感器能够有效评估污染程度。而光度计的检测范围为0至20,000 nM。通过建立校准曲线计算两个设备的LOD，结果显示CMOS传感器的LOD为22.5 nM，而EnSURE光度计的LOD为0.38 nM，这表明CMOS传感器在检测低浓度ATP时具有较好的性能。尽管CMOS传感器的LOD较高，但其样品体积（10 μL）远低于光度计所需的300 μL，这意味着CMOS传感器能够在较小的样本体积中获得相似的灵敏度。

图:1：图abcde为不同缓冲液中（Invitgen Buffer和UltraSnap Buffer）检测ATP的CMOS器件、发光计和平板阅读器的分析性能和比较。ATP浓度以对数标度表示，以覆盖整个浓度范围。插图中显示了试验所研究器件与其他两个设备类似的线性范围。

③通过对收集的化学发光强度进行分析得知，该器件在多个CMOS传感器之间表现出良好的可重复性（RSD为9.20%)。这一百分比证明了其在ATP的线性检测范围内具有良好的重现性。

图2：A)使用同一设备在UltraSnap缓冲液中演示10次测量(n=10)1μM ATP的生物传感器的重复性(n=10)；b)使用10种不同设备演示UltraSnap缓冲液中1μM ATP的10次测量(n=10)的生物传感器的重复性。

④该器件与商业发光计性能对比方面，结果表明，用CMOS仪和Luminometer测得的三磷酸腺苷浓度与溶液中的实际浓度有很好的一致性。具体地说，y=x线的确定系数(R2)对于发光计是0.95，对于cmos是0.98。

⑤实际样品检测的结果显示：两个设备在病原微生物污染水平的检测上高度一致，且在相同的污染情况下，CMOS传感器的ATP浓度值普遍高于光度计，平均偏差约为40%。结合情况讨论，这种差异可能与样品准备过程中的细节差异有关，即CMOS设备是将样品直接放置在传感器表面，而光度计则使用了超声波管和试剂，部分样品可能在管壁吸附，导致测量误差。

图3：真实样品分析。使用 Hygiena UltraSnap 拭子进行采样。对相同的表面积进行 3 次 （a）、（b）和（c）采样，以使用光度计和 CMOS 测量 ATP。基于图3c和图3d中所示的用于发光计和cmos的校准曲线来确定恢复的ATP浓度。（d）显示了使用光度计和 CMOS 回收的浓度之间的比较，根据光度计值进行了归一化。

总体而言,该项研究开发的基于像素化CMOS图像传感器的新型ATP检测设备具有可靠的性能，展示出高达1μM的线性响应和225 fmol的检测限（LOD）。灵敏度上更是达到飞摩尔级别（与现有的光度计相当)，在多个CMOS传感器之间表现出良好的可重复性（RSD为9.20%)，成本与目前商业化的光度计相当或更低，且对样品和试剂的需求较低。然而需要思考的是，该设备在区分病原微生物的种类以及区分细胞外ATP、死细胞、食物残渣等有机物和细胞内ATP之间仍然存在挑战。

图4：该图示为器件的制造和使用过程。研究通过去除原始镜头和红外滤光片来优化设计，从而减少样品与传感器表面之间的距离，提升了光子采集效率。为了防止光反射干扰并增强信噪比，使用不透明的PDMS材料制造了样品架，通过切割压敏双面胶带以匹配微流控通道的尺寸，使用掩膜对准器(OAI Model 200)将不透明白色的PDMS器件精准对接到CMOS传感器。在传感器的操作中，从表面污染物采集提取ATP与液态稳定试剂混合后，样品（10μL）被转移至CMOS图像传感器表面进行化学发光（CL）反应。反应后的CL信号在暗室内通过传感器进行测量。记录信号15 S(曝光时间)。结果随后在Raspberry PI触摸屏LCD上显示。较高的ATP浓度意味着更多的表面污染，并导致更强烈的CL排放。

DOI: 10.1016/j.bios.2024.116200