Chip-Tip 工作流程赋能深度单细胞蛋白质组学，灵敏度与可扩展性双提升

单细胞蛋白质组学（SCP）是通过直接测量单细胞蛋白质组及其翻译后修饰（PTM）来加深对细胞分化和疾病理解的新兴领域。然而，SCP目前面临序列深度、通量和可重复性不足的挑战。本研究通过关键方法学改进，显著提升了单细胞蛋白质鉴定的灵敏度、覆盖率和可靠性。SCP主要采用无标记定量分析（LFQ）和多路复用分析两种技术。LFQ通过裂解细胞、提取蛋白质、消化成肽段，再利用液相色谱（LC）分离和质谱（MS）分析来识别和定量单细胞中的肽段。多路复用分析则通过同位素标记实现多个样本的同时分析。最新的plexDIA技术结合了DIA的优势，提高了蛋白质定量的准确性和效率。尽管如此，当前的SCP技术仍需改进质谱灵敏度和样品制备方法，以减少样品处理过程中的肽段损失。

为此，叶子璐团队开发了一种名为Chip-Tip的几乎无损的基于LFQ的SCP方法，能够在单个HeLa细胞中鉴定出超过5000种蛋白质和40000种肽段。该方法还可以直接检测单细胞中的PTM，无需特定的PTM富集。Chip-Tip工作流程在灵敏度和通量方面为SCP设定了新的标杆，并在基础生物学和生物医学领域中被广泛应用于鉴定细胞类型特异性标志物和治疗靶点。

1、研究方法：

A. Chip-TipSCP的工作流程和结果

图 1Chip-TipSCP 的工作流程和结果

在单细胞蛋白质组学（SCP）样本制备中，关键在于减少表面吸附损失、缓冲液蒸发和移液步骤，以提高重现性和灵敏度。基于此，研究人员开发了一种超高灵敏度的SCP工作流程（图1a）。该工作流程采用cellenONE X1平台和proteoCHIP EVO 96芯片，能够在纳升级别处理单细胞样本，同时制备多达96个细胞的蛋白质组学样。该芯片与Evosep One液相色谱系统兼容，简化了样本转移过程。在LC-MS/MS分析中，结合了Evosep One的Whisper流速方法和IonOpticks nanoUHPLC色谱柱，以最大化灵敏度和色谱性能。

研究者团队最近推出的nDIA方法应用于Orbitrap Astral质谱仪后，大大提高了SCP分析的灵敏度和效率。优化后的nDIA方法（4Th6ms）在单个HeLa细胞中鉴定出5204种蛋白质的中位数，以及超过6000种蛋白质（图1b）。在肽段水平上，单细胞样本中位数鉴定出41700种肽段，20个细胞样本中位数鉴定出98054种肽段（图1c），蛋白质序列覆盖率达到12.9%和25%（图1d）。这种深度的肽段覆盖使得蛋白质定量非常精确，iBAQ值显示出广泛的动态范围（图1e）。研究者团队的SCP谱图涵盖了所有亚细胞定位的蛋白质，显著鉴定出超过200种质膜蛋白，强调了该方法的稳健性（图1f）。

B. 增强无标记SCP中的载体蛋白质组效应

图 2 评估SCP中的载体蛋白质组效应

在无标记定量（LFQ）的单细胞蛋白质组学（SCP）中，每个细胞通过带有nDIA的LC-MS/MS独立分析，避免了多路复用SCP的信号干扰。为了增强单细胞的蛋白质组学鉴定数量，目前最常使用Spectronaut和DIA-NN两种工具。这些策略通过整合高数量样本数据提高单细胞样本的鉴定数量，但其具体效果仍需进一步研究。作者对Spectronaut和DIA-NN进行了系统评估，发现包含“载体蛋白质组”可显著增加鉴定数量（图2a，b）。在Spectronaut中，随着单细胞文件数量增加，鉴定数量从约4000个增加到5000个（图2c），且载体蛋白质组有助于识别低丰度蛋白质（图2d）。此外，作者比较了单细胞和20个细胞样本的两次独立运行结果（图2e，f），发现不同细胞和工具间的一致性较高。Spectronaut的定量相关性略高于DIA-NN（图2g，h），但同一细胞的Spectronaut和DIA-NN之间的相关性较低（图2i）。此外，作者使用Spectronaut和DIA-NN的陷阱数据库搜索策略进行了错误发现率基准测试，评估了鉴定的可靠性。

C. 液相色谱方法和 FAIMS提高SCP性能

为了解决无标记单细胞蛋白质组学（SCP）中质谱（MS）通量限制的问题，研究者采用Whisper Zoom方法，将Evosep One液相色谱系统的通量从每天40个样品（SPD）提升至80个甚至120个样品。这一改进不仅提高了通量，还增强了色谱性能，同时保持了高灵敏度，使用80SPD和120SPD方法在单个HeLa细胞中鉴定出超过4500种蛋白质，并通过分析不含单细胞的空白样品来检测潜在的污染和残留。这些空白样品的蛋白质鉴定结果非常少，证明了该工作流程的稳定性和低污染风险。

作者还使用配备前端高场不对称波形离子迁移谱（FAIMS）接口的Vanquish Neo液相色谱和Orbitrap Astral，以最大限度地减少背景干扰。使用cellenONE分离单细胞，并在低结合力96孔板中制备样品，直接进行MS注射。使用-48V的补偿电压，FAIMS Pro Duo接口进一步增强了分析性能，使得单个HeLa细胞中鉴定出超过6500种蛋白质。通过空白样品的分析结果得知，该工作流程依然能够保持无污染的性能。

D. 翻译后修饰（PTM）分析的突破

通常，PTM分析需要对携带PTM的肽段进行特异性富集，但该工作流程的SCP数据的高肽段覆盖率使该团队能够在没有特异性富集的情况下鉴定PTM。作者绕过了任何特定的富集过程研究了单细胞样本中两种关键PTM（磷酸化和糖基化）的普遍性。尽管未进行特定的磷酸化位点保留处理，作者使用该工作流程在单细胞中鉴定出120个磷酸化Ser、28个磷酸化Thr和13个磷酸化Tyr位点的中位数，位点定位概率很高。此外，团队还检测到多种糖基转移酶，并通过氧铵离子筛选确认了糖基化的存在。尽管如此，由于数据库搜索算法的局限性，修饰肽的精确鉴定仍具挑战性。

2、应用实例

A. 5-FU 暴露后球体的SCP分析

为了验证该流程的SCP方法在80SPD的适用性，作者研究了化疗药物5-FU对结直肠癌细胞球体的影响。经5-FU处理的球体在20分钟解聚缓冲液处理后，随时间表现出更多的崩解，而对照球体保持紧凑，显示5-FU对细胞凝聚力的影响。单细胞分析鉴定出>2500种蛋白质。5-FU激活途径显示TYMP轻微上调，这对5-FU转化为DNA掺入活性形式至关重要，也是药物疗效的关键指标。基因本体（GO）术语的分层聚类显示，5-FU影响的生物过程包括环化酶细胞质活性和核糖嘌呤合成，这些过程直接受到5-FU对核糖体RNA合成的机制影响，核糖体和嘌呤/嘧啶合成是5-FU的主要靶点。UpSet图进一步剖析了5-FU的影响，详细说明了受治疗影响最大的过程及其调节趋势。相关蛋白质的改变突出了特定蛋白质，如ADCY和角蛋白，这些发现表明5-FU对球体稳定性和嘌呤代谢的靶向破坏。

B. hiPSC 分化

该工作流程可定量单个HeLa细胞中的 5000 多种蛋白质，足以识别特定细胞标志物。作者通过胚状体（EB）诱导，研究了人类诱导多能干细胞（hiPSCs）的无定向分化，模拟早期胚胎特征。还定量了 hiPSC 中的 4700 种蛋白质和 EB 细胞中的 6200 种蛋白质，表明该方法能够检测到稀疏表达的转录因子。实验结果显示，与EB细胞相比，hiPSC 中参与有氧呼吸和线粒体呼吸链复合物I组装的蛋白质水平较低，粘附蛋白水平较低，但参与细胞周期、DNA 复制和染色质重塑的蛋白质水平较高。因此，该团队的分析为干细胞分化提供了有价值的生物学见解，涵盖了一般途径和特异性低丰度生物标志物。

3、创新点

高灵敏度的单细胞蛋白质组学（SCP）分析流程

无需特定 PTM 富集的翻译后修饰（PTM）分析

高通量样本处理能力

低污染和高稳定性的操作流程

在干细胞分化研究中具有较大的应用潜力

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41592-024-02558-2