内源性酶激活的AND逻辑门DNA纳米机器，专为细胞内miRNA检测与细胞选择性成像设计

miRNA是一类短的非编码RNA分子，通过与mRNA相互作用调控蛋白质翻译，在细胞周期、分化和增殖等过程中起重要作用。其异常表达与肿瘤的发生发展密切相关，被视为重要的肿瘤生物标志物。传统的RT-qPCR检测方法因RNA提取复杂，难以在活细胞中原位分析miRNA。DNA纳米机器具有高度可编程性和分子信号转换能力，为miRNA原位分析提供了新策略。

1、实验步骤

A. AuNCs-DNAs纳米机器的合成

作者详细描述了AuNCs-DNAs纳米机器的合成过程，包括以下步骤：

a) H1和H2两条含有发夹结构的DNA链在95°C下金属浴处理10分钟，随后缓慢冷却至室温。

b) 将所有单链和发夹结构的DNA链混合，在37°C下水浴孵育2小时，形成四条稳定复杂的DNA链。

c) 将四条DNA链与1 mM TCEP-HCl按1:100的摩尔比混合，在室温下孵育60分钟，以减少二硫键的存在。

d) 按特定比例混合A、B、C和D链，加入1% Tween 20使最终浓度达到0.05%，再加入0.1 M PBS缓冲液（pH 7.4）使最终浓度达到0.01 M。

e) 在8小时内分四次向混合物中加入2 M NaCl，使终浓度达到0.3 M。静置一夜后，以3000 rpm离心12分钟去除游离DNA。

f) 用25 mM Tris-HCl（pH 7.4）洗涤产物两次，然后在室温下保存于Tris-HCl缓冲液中备用。

B. 共聚焦荧光成像分析

在实验中，AuNCs-DNAs被引入细胞后，经过特定时间培养，随后用PBS洗涤细胞两次并用100 μL DAPI染色5分钟，再次用PBS洗涤两次后，使用共聚焦显微镜观察。对于12孔板中的细胞，在与AuNCs-DNAs孵育后，同样用PBS洗涤两次，接着用1 mL胰蛋白酶处理3分钟进行消化，通过加入完全培养基终止消化。收集细胞悬浮液后，以1100 rpm离心5分钟，去除上清液，用500 μL PBS溶液重悬细胞，最后使用流式细胞仪进行分析。

2、结果与讨论

A. AuNCs-DNAs纳米机器的表征和可行性分析

图 1 酶特异性验证

AuNCs-DNAs纳米机器由A链、B链、C链、D链和AuNCs组成。在癌细胞中，由于脱嘌呤/脱嘧啶内切酶1（APE1）和miRNA-21的存在，AP位点被识别并切割，释放出Cy3荧光信号。随后，在miRNA-210和端粒酶（TE）的存在下，S4链被切割，恢复Cy5荧光信号。

实验结果表明，如图1A和B所示，随着APE1浓度的增加，Cy3的荧光强度发生变化。同样，在加入miRNA-210和TE后，Cy5的荧光强度显示出对TE浓度的依赖性（见图1D和E）。如图1C所示，外切酶I（EXO1）、谷胱甘肽（GSH）、DNA连接酶1（LIG1）、Nt.BbvCI和Flap内切酶1（FEN1）的荧光强度与APE1有显著差异。此外，还采用了以下处理方法：用TE抑制剂处理的MDA-MB-231细胞的TE提取物、正常细胞的TE提取物、热变性的TE提取物、未添加引物的AuNCs-DNAs、EXO1和GSH。在六个实验组中，仅检测到微弱的Cy5荧光信号（见图1F）。这些结果表明，AuNCs-DNAs对其他主要生物分子具有抗干扰能力，并且对两种酶具有很高的选择性。同时，实验还优化了DNA纳米机器的检测性能，确定了最佳的A、B、C和D链的比例为1:2:2:4，以及最佳的检测时间为100分钟。

B. 体外检测AuNCs-DNAs纳米机器

图 2 AuNCs-DNAs纳米机器的体外荧光特性

在实验中，研究团队构建了一个体外检测反应体系，包含4 U/mL的APE1、80 μL的MDA-MB-231细胞端粒酶提取物、100 μg/mL的AuNCs-DNAs纳米机器和10 nM的Mg2+。通过向反应溶液中添加不同浓度的miRNA-21和miRNA-210模拟物，并监测荧光信号随时间的变化，结果显示，随着miRNA-21（图2A-B）和miRNA-210（图2D-E）浓度的增加，Cy3和Cy5的荧光强度持续上升。在0-10 nM的浓度范围内，荧光信号强度与miRNA浓度呈线性关系，miRNA-21和miRNA-210的检测限分别为0.045 nM和0.043 nM。这些结果表明，DNA纳米机器能够检测癌细胞中低丰度表达的两种miRNA。

此外，实验还验证了AuNCs-DNAs对不同miRNA的特异性。结果表明，只有含有miRNA-21的溶液才显示出强烈的Cy3荧光信号（图2C）。进一步地，在反应溶液中加入miRNA-21模拟物和完整的AuNCs-DNAs后，只有在添加miRNA-210模拟物时，才检测到强烈的Cy5荧光信号（图2F）。此外，实验还证实了因miRNA-210的存在而形成的MNAzyme活性对Mg2+的依赖性，只有在补充了Mg2+的溶液中才观察到强烈的荧光信号（图2G），并且只有在两个目标miRNA同时存在的情况下，才能检测到强烈的Cy3和Cy5荧光信号（图2H和I）。

C. 活细胞中miRNA的荧光成像

实验通过CCK-8实验和活/死细胞染色评估了AuNCs-DNAs的细胞毒性。结果显示，AuNCs-DNAs具有良好的生物相容性。在MDA-MB-231细胞中，AuNCs-DNAs能够成功区分肿瘤细胞和正常细胞，并且能够区分不同类型的癌细胞。此外，实验还验证了AuNCs-DNAs在细胞中实现AND逻辑的能力。具体而言，通过共聚焦显微镜观察到，只有在同时存在APE1、miRNA-21、miRNA-210和TE的情况下，细胞才会产生强烈的荧光信号，这验证了AND逻辑门的功能。

D. 体内miRNA的检测

 图 3 小鼠体内荧光信号变化及组织病理学分析

实验通过在肿瘤小鼠模型中进行荧光成像，验证了AuNCs-DNAs的体内检测能力。结果表明，AuNCs-DNAs能够在肿瘤部位特异性激活，并实现对两种miRNA的成像（图5A-B）。具体而言，小鼠在注射AuNCs-DNAs后，肿瘤部位的Cy3和Cy5荧光信号在2小时后开始出现，8小时达到峰值，12小时后逐渐减弱。随后，解剖小鼠并进行荧光成像，以分析心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肿瘤中的信号。研究者对小鼠的主要器官进行了组织学分析，结果表明未观察到显著的病理变化（见图5C）。同时，小鼠血液生化和血常规检查的结果表明，纳米机器与仅注射生理盐水的小鼠之间在各项指标上没有显著差异，表明纳米机器具有良好的生物相容性。

3、创新点

A. 特异性检测：利用癌细胞中的酶（APE1和TE）实现对miRNA的特异性检测。

B. 信号放大：通过链置换反应和酶活性恢复，提高低丰度miRNA检测的灵敏度。

C. 细胞选择性成像：区分癌细胞和正常细胞，助力肿瘤精准诊断。

D. 体内成像验证：在小鼠模型中验证了纳米机器的特异性激活和成像能力。

E. DNA纳米技术应用：构建分子逻辑门，展示其在生物医学检测中的灵活性。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.talanta.2024.127087