突破性dsRNA检测革新，引领mRNA疫苗质量新高度

mRNA疫苗自SARS-CoV-2疫情以来，逐渐成为对抗SARS-CoV-2的强大武器。辉瑞和Moderna公司的SARS-CoV-2 mRNA疫苗批准上市和广泛应用后充分证明了mRNA疫苗的适用性和技术先进性。但与传统疫苗相比，mRNA疫苗的临床风险尚未得到充分研究。在体外转录（IVT）步骤中，噬菌体RNA聚合酶如T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）将DNA模板转化为mRNA，以其在RNA合成中的高保真度而闻名。然而，这一生物过程并非完全无误。它有时会导致某些mRNA副产物的产生；特别是双链RNA（dsRNA）的形成，其本身具有免疫原性，会引发体内的炎症反应。这种副作用在mRNA治疗应用中是不希望出现的。目前dsRNA对mRNA治疗效果的影响仍然是一个尚未全面探索的主题。鉴于dsRNA相关的潜在临床风险，在mRNA疫苗的生产和制备过程中实施强有力的dsRNA检测和控制至关重要。

然而，现有的dsRNA检测方法存在许多局限性。例如，辉瑞获批的mRNA疫苗依赖于斑点印迹法进行dsRNA检测，这种技术检测结果粗糙，且只能半定量。这种方法可能由于当时疫情的紧迫性而被采用，但不适合满足mRNA疫苗放行和临床研究的严格要求。因此，在mRNA研究和应用领域迫切需要开发一种准确且灵敏的dsRNA检测方法。刘晶晶团队开发了一种对dsRNA表现出高特异性，对基质成分、IVT酶和反应系统中存在的其他潜在干扰源显示出强大抗干扰能力的dsRNA检测方法，为dsRNA的研究以及随后的mRNA疫苗研究提供了科学价值。

研究步骤：

A. dsRNA抗原合成：如图1A，研究者选择IVT来分别合成正负链，然后退火形成dsRNA，并通过单链RNA酶和DNase I消化去除单链RNA（ssRNA）或模板，获得dsRNA抗原或标准品。

B. 多轮抗体筛选：研究者首先将合成的dsRNA用于免疫小鼠，在三次加强免疫后进行细胞融合以筛选杂交瘤细胞，从6只小鼠中获得了119个dsRNA结合抗体。之后，通过ELISA筛选试验获得了62个结合阳性抗体，其中48株优选用于后续筛选（图1B）。接着研究者利用间接ELISA方法，根据EC50值作为指标对优选抗体进行排名和分析，部分亲和力分析结果如图1C。同时，他们将62个结合阳性抗体分别对ssRNA、双链DNA（dsDNA）和单链DNA（ssDNA）进行ELISA试验，测量OD450值，根据dsRNA与ssRNA（图1D）、dsDNA（图1E）或ssDNA（图1F）的OD450比值大于5的标准选择具有优越灵敏度和特异性的抗体。最后使用夹心ELISA方法分别测量对dsRNA和ssRNA的响应值。最终选择了针对dsRNA最优的抗体对，即M2和M5（图1G）

C. 结构分析：利用冷冻电镜（Cryo-EM）技术和蛋白质-核酸复合物预测模型，研究者分析了dsRNA-抗体复合物的结构，阐明了抗体对结合dsRNA的分子基础。

D. 确认dsRNA标准品：研究者首先使用M2和M5抗体对测试了dsRNA的最短识别长度。结果与经典的J2和K2抗体对类似，而本研究中的M2和M5抗体对只能识别大于40 bp的dsRNA（图1I），这与dsRNA在体内引发先天免疫所需的最短长度一致。接着，为了筛选和获得合适的dsRNA标准品，团队检测了M2和M5抗体对对不同长度dsRNA的反应性。结果表明，M2和M5抗体对在200 bp到2000 bp的dsRNA片段中表现出一致的反应性。因此，研究者选择了中等大小的500 bp dsRNA作为后续研究的检测标准，并测试了合成的dsRNA标准品的纯度。通过琼脂糖凝胶电泳和HPLC-SEC分别验证了纯度超过95%。

E. 检测方法建立及验证：

① dsRNA标准品的稳定性：通过在不同时间点检测J2抗体与dsRNA结合的EC50值，检查了标准品的37°C加速和冻融稳定性。结果表明，dsRNA标准品在37°C下7天或7次冻融后的EC50偏差小于30%，表明标准品稳定（图1J）。

② dsRNA标准品的特异性：验证了ssRNA、dsDNA、ssDNA以及mRNA制备过程中使用的体外转录酶在0.046±1.5 ng/mL的线性范围内不会干扰检测系统（图1K），并使用经典的J2抗体和斑点印迹法对灵敏度和特异性分析进行了比较。结果表明，斑点印迹法的灵敏度相对较弱，约为6.25 ng/mL。此外，斑点印迹法的检测容易受到ssRNA、dsDNA和ssDNA等成分的干扰。

③ dsRNA标准品的灵敏度、精度和准确性：使用夹心ELISA评估了M2和M5抗体对对用UTP、ψ、N1-ψ修饰的dsRNA以及不同序列的dsRNA的反应性。结果表明，M2和M5抗体对对序列和碱基修饰的选择性很小（图1L）。此外，为评估dsRNA定量检测方法的批间和批内精度、准确性和总误差还进行了实验和分析。结果表明，精度误差<15%，准确度误差<20%，符合应用要求。

④ dsRNA标准品潜在的基质效应：对三种不同的mRNA样本进行了梯度稀释，分别测定它们的浓度并重新计算原始浓度。不同浓度的精度误差始终<15%，表明检测方法具有良好的稀释平行性，基质效应影响很小。

综合来看，研究团队开发的用于定量dsRNA的ELISA方法比现有的定量方法有显著改进，从而推进了mRNA疫苗的质量控制方法。为了进一步阐明在真实mRNA疫苗中质量控制的潜在应用，研究团队还使用该实验方法对来自三家公司的九批mRNA疫苗产品进行了dsRNA定量实验。结果表明，该方法具有高稳定性和定量一致性，与预期值相符，表明该方法适用于实际疫苗产品的质量控制。

研究意义

这项研究为mRNA疫苗的质量控制提供了一种新的、更有效的dsRNA检测方法，有助于提高mRNA疫苗的安全性和有效性。通过改进检测技术，可以更好地控制疫苗生产过程中的质量，减少不良反应，提升疫苗的整体性能。

原文链接：https://doi.org/10.1093/procel/pwae043