6小时锁定耐药菌：自启动微流控芯片的AST革命

原创

来源：邹晶晶

2025-02-14 09:50:44

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核心提示：抗生素耐药性（AMR）已成为全球健康的重大挑战，导致大量死亡和医疗成本增加。传统抗生素敏感性测试（AST）方法耗时长（通常需24小时），无法满足快速诊断需求。微流控技术以其快速、高通量、低成本的优势为AST提供了新解决方案，但现有技术仍存在设备复杂、操作繁琐等问题。基于此，Pang等人开发了一种自启动数字微流控芯片（SDM-AST），用于快速、单细胞水平的AST，以解决现有技术的局限性，实现快速、高效的现场快速检测（POCT）。

抗生素耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）已成为全球健康的重大挑战。2019年，AMR导致了约127万人死亡，若无有效干预，预计到2050年每年可能导致1000万人死亡。抗生素敏感性测试（Antibiotic Susceptibility Testing, AST）是应对AMR的关键工具，能够快速、准确地评估细菌对不同抗生素的敏感性，从而指导临床合理使用抗生素，提高患者的生存率并降低治疗成本。传统的肉汤稀释法虽然是AST的金标准，但存在诸多缺点，如需要大量样本、操作复杂、需要专业人员、易交叉污染、易人为错误，且需要长达24小时的培养时间，无法满足及时治疗的需求。微流控技术因其具有多种优势，如使用最少的试剂体积、成本效益高、高比表面积、能够在微尺度环境中集成多种功能，在分子诊断和细胞表型分析中已成为主导趋势，特别是在数字微滴微流控领域，能够实现高精度的流体控制和微流控过程的数字化。这些平台已扩展到单细胞水平的分析，包括在数字微滴中进行AST，能够高分辨率地分析细胞表型。尽管数字微滴微流控平台在分子诊断和细胞表型分析方面取得了显著进展，但在实际应用中仍面临挑战。例如，微滴的形成通常需要外部设备（如专用泵），这限制了其在资源有限环境中的应用。为了确保微滴在反应或培养过程中的稳定性，需要添加生物相容的表面活性剂，这增加了成本和操作复杂性。此外，标记物（如刃天青）可能从微滴中泄漏到周围油中，影响检测精度。微滴之间的交叉污染也是一个问题。鉴于上述挑战，Pang等人开发了一种自启动数字多重微流控芯片（Self-Priming Digital Microfluidic Chip, SDM-AST），用于快速、单细胞水平的AST。该芯片包含1824（456×4）个带有集成微阀门的微室（~15 nL），无需复杂的外部泵装置即可实现自启动样本加载。该芯片包含1824个微室（456×4），每个微室体积约为15纳升，通过集成微阀门实现自启动样本加载，无需复杂的外部泵。通过在芯片上预先沉积抗生素，实验时自分散细菌悬液（泊松分布），孵育后即可实现单细胞分辨率的药敏分析。芯片分析包含4个分区，这扩展了芯片的多重分析能力：既可以同时进行多种抗生素的筛选，亦可以进行同一抗生素多浓度的筛选（图1）。

芯片上活细菌的定量是进行AST分析的基础。为此，作者引入梯度稀释（10³-10⁵倍稀释）的肺炎克雷伯菌悬液入芯片中，孵育6 h后对细菌密度进行定量。结果显示，芯片上测定的细菌密度与稀释因子相关性较好，R²为0.996。不过，芯片上测定的菌密度会略高于平板计数法测定值（图2），这可能是因为：基于刃天青的数字分析方法可以检测到那些在琼脂平板上未能形成可见菌落的细菌。明确芯片上活细菌定量的可靠性后，作者展开了药敏分析。首先，作者探索了芯片定量K. pneumoniae S1及大肠杆菌（ATCC 25922）针对氯霉素（CHL）和环丙沙星（CIP）的MIC值的能力。结果显示，芯片上K. pneumoniae S1对氯霉素（CHL）和环丙沙星（CIP）的MIC值分别为：512和128 μg/mL。对此，K. pneumoniae S1对氯霉素（CHL）的MIC值相较于肉汤稀释法略高（±2倍，可接受），这种差异可能是由于在夜间冷冻干燥过程中抗生素的损失：CHL的溶剂为95 %乙醇，溶液中残留的乙醇含量仍会影响稀释后的冻干效果。至于大肠杆菌，对这2种抗生素均表现为敏感，与肉汤稀释法结果一致（图3）。进一步，作者在同一芯片上预先沉积4种相同浓度（64 μg/mL）的CHL、CIP、美罗培南（MEM）、甲氧苄啶（TMP），并利用K. pneumoniae S1和大肠杆菌（ATCC 25922）探索了在芯片上进行抗生素筛选的能力。结果显示，K. pneumoniae S1对CHL、CIP耐药，对MEM和TMP敏感；大肠杆菌对这4种抗生素均表现为敏感，与肉汤稀释法结果保持一致（图4）。由此，SDM-AST具备分析不同浓度和不同种类抗生素，并提供可靠的敏感性分类的能力。

总之，研究开发了一种基于自启动数字微流控芯片的SDM-AST方法，通过集成微阀腔室和预涂层技术，实现了快速样本加载和多种抗生素的敏感性评估，显著缩短了检测时间（6 h），提高了检测效率。未来研究应进一步扩展到更多临床分离株和抗生素种类，以增强芯片的实用性和普适性。此外，结合机器学习技术有望进一步提升检测能力。