基于CRISPR / Cas14a和Exo III的级联信号放大新型生物传感器：检测创伤弧菌的有力工具

　　副溶血性弧菌的威胁

　　副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种广泛存在于海鲜中的食源性病原体，对人类健康和公共安全构成严重威胁。食用受污染的海鲜后，该病原体可引发急性胃肠炎，症状包括恶心、呕吐、发热，严重时甚至可能导致休克、昏迷和死亡。副溶血性弧菌主要通过海鲜或海鲜产业链传播，已成为许多国家，尤其是沿海地区的主要公共卫生问题。

　　传统检测方法的局限性

　　目前，检测副溶血性弧菌的方法主要包括细菌培养和PCR分子检测。细菌培养方法耗时且繁琐，整个检测过程通常需要数天时间，包括预富集、选择性富集、鉴定等复杂步骤，难以满足临床样本的多样化需求。PCR或实时PCR检测方法虽然灵敏度高，但需要专业操作人员和特殊的热循环PCR仪器，以及复杂的样本处理过程，如特定蛋白质分离和总DNA / RNA提取，这些都极大地影响了样本处理进度，限制了其在即时检测和资源有限环境中的应用。

　　生物传感器的工作原理

　　该生物传感器的工作原理基于CRISPR / Cas14a的旁切活性和Exo III的切割反应。具体来说，当副溶血性弧菌存在时，它会特异性地结合到适配体(aptamer)上，释放出锁定的探针A。自由的单链探针A打开HP B，并与该结构的5′端形成双链DNA，而发夹连接结构B的3′端是单链的。Exo III随后催化HP B链的3′端沿3′-5′方向的逐步消化，生成ssDNA探针A和HP B的3′端序列的ssDNA。ssDNA探针A触发发夹HP B生成A / B复合体，该复合体再次被Exo III切割。ssDNA C被Cas14a-sgRNA识别，激活Cas14a的转切割活性，切割两端分别修饰有HEX和BHQ1的附近ssDNA探针，从而增强荧光。系统随后产生足够的HEX荧光，快速准确地检测致病菌。

　　图1 基于独特的侧链Cas14a裂解活性和Exo III裂解反应，荧光生物传感器检测副溶血性弧菌

　　生物传感器的灵敏度和特异性

　　为了提高生物传感器的性能，研究人员优化了多个重要因素，包括Exo III、锁定机制、HP B、缓冲液、Cas14a和sgRNA的浓度，以及反应温度和孵育时间。在优化条件下，生物传感器对不同浓度梯度的副溶血性弧菌产生的荧光强度进行了分析。结果表明，随着副溶血性弧菌数量的增加，生物传感器的荧光强度逐渐增加，且在102至107 CFU / mL范围内，荧光强度与副溶血性弧菌浓度的对数值呈显著线性关系，线性相关方程为Y = 1176X + 615.13(R2 = 0.9901)，检测限低至6 CFU / mL。此外，生物传感器对八种常见食源性病原体(包括大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌)的特异性分析显示，只有副溶血性弧菌(目标菌株)显示出强烈的荧光信号，而其他干扰菌株均未产生荧光强度，表明该生物传感器具有高特异性。

　　表1 作者的Cas14a-Exo III病原体检测生物传感器与文献中其他传感器的比较

　　实际样本应用

　　为了验证生物传感器在实际样本中的适用性，研究人员分析了橙汁、模拟海水和冷冻虾样本。将不同浓度的副溶血性弧菌(105–107 CFU / mL)分别加入到这些样本中，并使用生物传感器和PCR进行检测。PCR结果显示，橙汁、模拟海水和冷冻虾中均扩增出了副溶血性弧菌的特异性片段，证实了样本中存在副溶血性弧菌。生物传感器的检测结果与PCR一致，样本的平均回收率为94.61%–103.47%，RSD为8.53%–17.48%，表明生物传感器在检测实际样本中的副溶血性弧菌时具有良好的重现性。

　　表2 利用该生物传感器在真实样品中检测副溶血性弧菌

　　结论

　　研究人员成功开发了一种基于CRISPR / Cas14a系统和Exo III活性的新型生物传感器，能够特异性和灵敏地检测副溶血性弧菌。该生物传感器利用aptamer特异性识别目标、CRISPR / Cas14a转切割活性和Exo III切割活性的级联信号放大，减少了复杂的细菌核酸提取步骤和核酸扩增过程，降低了核酸污染的风险。该生物传感器策略显示出对目标病原体分析的优异选择性、灵敏度和便携性，尤其适用于复杂基质中副溶血性弧菌的检测。通过合理设计病原体aptamer，该平台还可用于分析其他病原体，因此在环境监测、食品安全和疾病诊断方面具有巨大的应用潜力。

　　参考文献：

　　Wang J, Sun H, Gao Y, et al. A novel biosensor for detecting V. parahaemolyticus based on cascade signal amplification of CRISPR/Cas14a and Exo III[J]. Food Control, 2025. 167: 110788.