磁性Fe3O4@MOF@核酸适体介导的熵驱动荧光生物传感器：实现多重病原菌的快速无创检测

原创

来源：曹璐璐

2025-02-27 14:47:46

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核心提示：本研究首次提出了一种基于磁性Fe3O4@MOF@核酸适体介导的熵驱动荧光生物传感器，用于多重和无DNA提取及扩增的病原菌检测。

　　引言

　　在食品和临床样本中快速、早期识别病原菌对于传染病控制和精准医疗至关重要。传统的病原菌检测方法如平板计数、酶联免疫吸附试验(ELISA)和聚合酶链反应(PCR)存在耗时长、操作复杂、成本高等缺点，且难以实现多重病原菌的检测。因此，开发一种快速、灵敏且无需DNA提取和扩增的病原菌检测方法具有重要意义。

　　研究背景与意义

　　近年来，基于核酸引导的内切酶如Argonaute(Ago)的分子诊断方法取得了重大进展。与CRISPR-Cas系统类似，Ago也是一种核酸引导的内切酶，能够在不依赖PAM序列的情况下实现多靶标检测。然而，现有的Ago系统如TtAgo和PfAgo需要高温条件，限制了其在非核酸靶标检测中的应用。为此，本研究成功表达和纯化了中温Ago——Clostridium butyricum Argonaute(CbAgo)，其在中等温度(37℃)下表现出高切割活性，显著扩展了Ago在生化分析领域的应用潜力。

　　材料制备与结构特性

　　Fe₃O₄/SiO₂/UiO66的制备

　　通过改进的水热法合成了Fe3O4/SiO2/UiO66复合材料。首先，将Fe3O4/SiO2与2-氨基对苯二甲酸和ZrCl4混合，在超声条件下反应，然后在120℃下反应24小时，得到Fe3O4/SiO2/UiO66.通过扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)等手段对材料的结构进行了表征。结果显示，Fe3O4/SiO2/UiO66具有均匀的球形结构，且UiO66在Fe3O4/SiO2表面均匀生长。

　　Fe₃O₄/SiO₂/UiO66/Apt的制备

　　采用盐老化法将核酸适体修饰到Fe3O4/SiO2/UiO66表面。将Fe3O4/SiO2/UiO66分散在Tris-HCl缓冲液中，加入S. aureus和E. coli的核酸适体，孵育12小时后，通过离心去除多余的核酸适体，得到Fe3O4/SiO2/UiO66/Apt。X射线光电子能谱(XPS)分析表明，Fe3O4/SiO2/UiO66/Apt表面成功修饰了核酸适体。

　　传感器构建与性能测试

　　1、传感器构建

　　将Fe3O4/SiO2/UiO66/Apt作为载体，结合熵驱动电路(EDC)和CbAgo，构建了MAEA生物传感器。Fe3O4/SiO2/UiO66/Apt能够快速分离和富集病原菌，EDC反应能够将低浓度的cDNA输入转化为高浓度的gDNA输出，CbAgo在gDNA的引导下特异性切割报告DNA，实现对E. coli和S. aureus的多重检测。

　　2、性能测试

　　在优化的实验条件下，MAEA生物传感器对E. coli和S. aureus的检测限分别达到79 CFU/mL和68 CFU/mL，具有宽线性范围和高灵敏度。此外，该传感器在实际食品和临床样本中表现出良好的准确性和特异性，能够同时检测两种病原菌，且无需DNA提取和扩增。

　　机制探讨

　　MAEA生物传感器的检测机制如下：首先，Fe3O4/SiO2/UiO66/Apt与病原菌和cDNA竞争性结合，由于核酸适体对病原菌的亲和力高于cDNA，因此在病原菌存在时，Fe3O4/SiO2/UiO66/Apt与病原菌结合，cDNA解离到溶液中。当病原菌不存在时，Fe3O4/SiO2/UiO66/Apt与cDNA杂交。经过磁性分离后，上清液中的cDNA含量与病原菌成正比。接着，上清液进行EDC反应进行信号放大。EDC反应中，Q/P/gDNA三链DNA复合物在目标cDNA存在时，cDNA与Q/P/gDNA复合物的toehold结合，导致P链解离，形成Q/gDNA/cDNA复合物。随后，燃料链(F)与Q/gDNA/cDNA复合物的toehold结合，释放gDNA和cDNA，再生的cDNA触发新的循环，实现cDNA的循环放大，产生大量的目标相关gDNA。最后，gDNA与CbAgo结合，特异性切割不同荧光修饰的报告DNA，实现对两种病原菌的检测。

　　实际应用

　　为了进一步验证MAEA生物传感器的实用性，研究者选取了市场上常见的鸡肉和猪肉样本进行检测。结果显示，MAEA生物传感器与标准平板计数法的检测结果具有较高的一致性，能够准确区分病原菌的阳性样本和阴性样本。此外，MAEA生物传感器还被用于临床样本的检测，与临床诊断结果相比，其检测E. coli和S. aureus的准确率分别为88%和87%，显示出良好的临床应用潜力。

　　结论

　　本研究首次提出了一种基于磁性Fe3O4@MOF@核酸适体介导的熵驱动荧光生物传感器，用于多重和无DNA提取及扩增的病原菌检测。该传感器结合了CbAgo的精确酶切特性和EDC反应的高效等温无酶信号放大，是一种强大的多重和高灵敏度检测工具。MAEA生物传感器在实际食品和临床样本中成功检测了E. coli和S. aureus，具有广泛的应用前景。未来的研究将集中在通过基因编辑和蛋白质工程技术改进CbAgo的结构，提高其酶切活性，无需信号放大即可实现检测。此外，MAEA生物传感器还将与人工智能技术和微流控芯片结合，实现智能化和高通量自动化检测。