模拟抗体的纳米酶介导的夹心式横向测流免疫检测鼠伤寒沙门氏菌

　　研究背景

　　沙门氏菌是全球公认的主要人畜共患病原菌，迫切需要快速、灵敏的控制方法。基于纳米酶的免疫传感器由于酶样活性和特异性而实现了更高的灵敏度。然而，催化底物反应的复杂后续和时间敏感的操作，再加上配对抗体的必要性，限制了基于纳米酶的免疫传感器的广泛应用和商业可用性。

　　研究思路

　　本研究采用一步水热法合成了PtMnIr三金属纳米酶(PMI)。利用其催化特性和对细菌的亲和力(短暂混合3分钟)，开发了一种用于检测沙门氏菌的无标记单抗体横向测流免疫检测(LFIA)方法用于检测鼠伤寒沙门氏菌(图1)。利用PtMnIr纳米酶粗糙的表面和对细菌的亲和力，PMI纳米酶可以直接粘附在致病菌的表面。该单一抗体的新型三明治策略在保持检测特异性的同时，降低了抗体筛选和免疫探针制备相关的成本和复杂性。一方面，它克服了传统三明治检测设计和应用中识别分量的局限性，另一方面，利用纳米材料优异的物理化学性质，提供稳定多样的多重信号。纳米标签材料结合了捕获功能和信号输出的优点，消除了对识别分子的需求。此外，多信号自校准增强了检测性能，是“一人多角色”的完美范例。通过采用独立设计和3D打印技术制备了一个用于批量和平行检测的催化耦合器，在催化反应中，耦合器能够保持检测线的高度一致，使得反应能够同时开始和停止，从而提高检测的准确性和便捷性。

　　图1 (A)PtMnIr纳米球的合成，(B)LFIA的无标记和mAb标记模式的比较，(C)先前的复杂催化过程，(D)催化耦合器及其操作的示意图。

　　研究内容及结果

　　（1）三金属纳米球的制备与表征（图2）：通过一步水热法合成三金属纳米球。扫描电镜(SEM)结果表明，PtMnIr由连续或单分散的球形颗粒组成，透射电镜(TEM)结果表明PtMnIr具有坚实的结构和类似覆盆子的粗糙表面，线性扫描图和元素映射分析表明纳米颗粒由Pt、Mn和Ir三种元素均匀分散组成，其粒径分布在110到130 nm之间，平均粒径为122 nm。X射线粉末衍射(XRD)分析其晶体结构，发现具有特征衍射峰，表明形成了合金相且无可检测的杂质峰。利用X射线光电子能谱(XPS)识别PtMnIr的价态，发现Pt的结合能与金属Pt0符合，并揭示了金属Pt²⁺的存在。Mn的价态通过其特征峰也得到了鉴定。这些结果表明成功合成了PtMnIr纳米球，并为其出色的纳米酶活性进行初步研究奠定了基础。

　　图2 PtMnIr纳米球的表征(A)SEM图像(标尺：1 μm);(B)TEM图像(标尺：1 μm和50 nm);(C)线性扫描图像;(D)元素映射分析;(E)细菌结合前后的Zeta电位以及粒度分布;(F)XRD;(G)PtMnIr的XPS结果突出了铂的存在和化学状态;(H)XPS结果显示了PtMnIr中的Mn;(I)XPS结果表明PtMnIr中存在Ir。

　　（2）PtMnIr纳米球的过氧化物酶模拟活性探究（图3）：离心后分别测定上清液和沉淀物的催化性能，结果表明只有沉淀物表现出明显的催化信号，表明PtMnIr纳米酶的催化能力源于纳米球本身，而非离子扩散。此外，TMB、OPD和ABTS作为有机底物，仅在添加PtMnIr纳米酶后，底物才会发生颜色反应，分别在652nm、447nm和415nm处出现特征吸收峰。TMB的反应强度最强，因此被选为后续的催化底物。通过电子自旋共振(ESR)分析，检测到O₂⁻、•OH和¹O₂等自由基，其中•OH和¹O₂占主要比例，说明PtMnIr纳米酶可能通过产生自由基来催化TMB的氧化。稳态动力学评估结果表明纳米酶对TMB的Km值为0.093 mM，Vmax为17.46×10⁻⁸ M/s，表明其具有较高的催化速率，适合快速检测;对H₂O₂的Km值为29.77 mM，Vmax为39.88×10⁻⁸ M/s，表明纳米酶与底物具有较强的亲和力。进一步测试表明经过5次催化循环后，PtMnIr纳米酶的催化活性损失率为10.7%，在室温下保存两个月后，PtMnIr纳米酶的催化活性仅下降5.78%，证明合成的纳米酶具有较好的循环催化能力，在酸性条件下表现出较强的酶活性，并具有良好的稳定性和重复性，适合作为传感器中的催化标签，用于快速检测。

　　图3 PtMnIr纳米酶催化能力的评价。(A)沉淀和上清液催化溶液的紫外-可见光谱;(B)不同催化底物(TMB、ABTS和OPD)的紫外-可见光谱;(C)过氧化物酶和氧化酶活性的测定;(D)ESR法测定自由基。(E)纳米酶循环的损失率;(F)催化活性与pH值的关系;(G)TMB的Michaelis-Menten饱和曲线;(H)H2O2的Michaelis-Menten饱和曲线;(I)纳米酶的稳定性(两个月)和催化原理。

　　（3）无标记三明治检测的验证和可行性评估（图4）：结果表明，PtMnIr纳米球对革兰氏阳性和阴性菌均具有广泛的结合能力，尽管其结合机制尚未完全明确，但可能与表面蛋白结合、表面粗糙度以及铂元素的影响有关。这种结合特性为开发基于单抗体的夹心检测免疫传感器提供了新的思路，有助于提高检测灵敏度和特异性。为确保平行实验的精确性以及简化梯度实验过程，使用3D打印技术开发了一种用于批量和平行检测的催化耦合器，其长度与96孔板相匹配，每个槽位与检测孔一一对应，可以同时容纳10条试纸条进行反应，使用相机可以快速批量拍摄照片，并进行数据分析快速确定实验结果，显著提高了检测效率，同时降低了检测人员的操作复杂性。

　　图4 无标记平行催化免疫传感器的概念验证。(A)和(B)SEM和TEM图像描述鼠伤寒沙门氏菌与PtMnIr纳米球的结合(标尺：3 μm和1 μm);(C)在没有PtMnIr纳米球的情况下对鼠伤寒沙门氏菌进行荧光染色;(D)和(E)SEM和TEM图像揭示金黄色葡萄球菌和PtMnIr纳米球之间的相互作用(标尺：3 μm和1 μm;(F)PtMnIr纳米球对鼠伤寒沙门氏菌进行荧光染色(标尺：20 μm);(G)平行分批催化耦合器的概念图;(H)实际应用图片。

　　（4）检测体系优化：通过优化检测条件，确定体系最佳检测性能时所需PtMnIr纳米球的浓度为4 mg/mL，共孵育时间为3分钟，检测时间为20分钟，山羊抗小鼠抗体染色使用茜素红染料用量为4 μL，LFIA检测平台的催化时间为30秒。

　　（5）方法检测性能评估：将研究构建的由PtMnIr纳米球、鼠伤寒沙门氏菌和固定抗体形成夹心结构的免疫分析方法(PMI-free-LFIA)与双抗夹心法(PMI-mAb-LFIA)及胶体金标记抗体的夹心免疫分析法(AuNPs-LFIA)三种模式进行对比，结果表明PMI-free-LFIA的灵敏度与PMI-mAb-LFIA相当，比AuNPs-LFIA高出5倍。在催化模式下，PMI-free-LFIA的灵敏度比比色模式高出10倍，比PMI-mAb-LFIA高出10倍，比AuNPs-LFIA高出50倍。总体而言，PMI-free-LFIA在检测鼠伤寒沙门氏菌方面表现出优异的检测性能，具有较高的灵敏度、良好的特异性和抗干扰能力。

　　研究结论

　　本研究利用PtMnIr纳米酶的催化特性，开发了一种无标记LFIA平台，用于检测鼠伤寒沙门氏菌。该方法具有无需成对抗体、高稳定性和灵敏度、以及实际应用便利性等优势。本研究为纳米酶催化免疫传感器的快速发展做出贡献，未来仍需进一步提高抗体和纳米标签的特异性以增强其性能。

　　创新点：

　　(1)纳米酶能够高效捕获目标菌，无需额外修饰，并提供比色信号和催化功能，双信号输出和自校准互验证提高了检测的准确性和灵敏度;

　　(2)通过引入3D打印的催化耦合器实现批量平行催化反应，降低操作复杂性，提高了检测效率及实际使用的便利性;

　　(3)利用三金属纳米球与细菌的结合能力，采用单抗体依赖的夹心模式，无需额外的成对抗体，设计了一种低成本、无标签的LFIA检测方法。

　　论文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.159862