双模态比色/SERS侧流免疫分析法结合机器学习优化的超灵敏霉菌毒素检测技术

　　研究背景

　　脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是一种常见的霉菌毒素，广泛存在于谷物和动物饲料中，具有致癌、致畸、致突变和基因毒性，对公共卫生和经济构成严重威胁。现有的检测方法(如酶联免疫吸附测定、高光谱成像、近红外光谱等)存在数据处理复杂、环境敏感性和信号干扰等问题，急需开发一种灵敏、特异、高效、简单且用户友好的现场检测平台。侧流免疫分析(LFIA)因其简单、低成本、用户友好、快速检测和灵敏度高而在霉菌毒素检测中取得显著成功。然而，传统LFIA依赖于金纳米颗粒，其亮度不足限制了检测灵敏度和定量能力。

　　研究思路

　　本研究构建了一个基于复合纳米材料(RASPs)的比色-SERS双模式测流免疫分析平台。首先以铑(Rh)纳米粒子为核心，其稳定性、精确的尺寸控制和强表面等离子体共振效应可以增强拉曼信号强度。为进一步提高SERS性能，将银纳米粒子涂覆在Rh粒子上，以增加表面积并增强间隙等离子体效应放大等离子体共振。然后将普鲁士蓝纳米粒子(PBNPs)包覆在外层，由于其生物相容性和在2156 cm−1处固有的拉曼信号而作为拉曼信号分子，从而最大限度地减少干扰并提高检测特异性。图1A展示了比色-SERS双模态侧流免疫分析系统的工作原理。在这种竞争性免疫分析中，随着DON浓度的增加，T线的颜色逐渐变浅。定性和半定量分析可以通过目视或仪器完成。当比色模式在极低或极高浓度下失效时，可以使用便携式拉曼光谱仪(785 nm激光)聚焦T线进行SERS模式检测。拉曼信号强度通过软件处理以实现对DON浓度的准确测量。此外，开发了针对LFIA量身定制的机器学习模型，使得比色读数和拉曼信号均通过机器学习算法进行分析，以有效分类并精确预测DON污染水平，提高检测体系的专一性和系统的可用性。

　　图1(A)比色-SERS双模态侧流免疫分析系统的工作原理;(B)基于机器学习优化的比色和SERSLFIA分析方法在谷物DON分类和预测中的应用。

　　研究内容及结果

　　（1）RASPs的制备与表征（图2）：研究优化了铑纳米颗粒(Rh NPs)的合成条件和银涂层结构，以获得具有最强且最稳定性能的RASPs纳米结构。X射线光电子能谱(XPS)分析表明RASPs主要由C、N、Ag、Rh和Fe组成，XPS光谱证实了普鲁士蓝纳米涂层(PBNPs)的存在，普鲁士蓝通过Fe²⁺和Fe³⁺形成的三键桥与Rh@Ag纳米颗粒相连，通过氰基配位键进一步连接，减少了背景噪声;粉末X射线衍射图谱(XRD)确认了Rh、Ag和普鲁士蓝的结构与其面心立方形式一致，验证了组分整合;Zeta电位结果表明由Rh纳米颗粒到复合RASPs，电位逐渐降低，证实了抗体的成功结合;傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析确认了O−H伸缩振动、C=O伸缩振动、CN键伸缩振动以及Fe−N振动，表明普鲁士蓝成功包覆;紫外-可见吸收光谱(UV−vis)结果说明Rh@Ag纳米颗粒表现出更强的紫外吸收，归因于表面等离子体共振(SPR)，RASPs显示出最高的吸收强度，归因于普鲁士蓝和Rh@Ag的联合光学特性。

　　图2 RASPs的表征。(A)Rh 3d、(B)Ag 3d、(C)Fe 2p和(D)N 1s的XPS图谱;(E)RASPs的XRD图谱;(F)Rh纳米颗粒、Rh@Ag纳米颗粒、RASPs、DON-mAbs以及RASPs-mAbs复合物的Zeta电位测量;(G)Rh纳米颗粒、Rh@Ag纳米颗粒和RASPs的FT-IR图谱;(H)Rh纳米颗粒、Rh@Ag纳米颗粒和RASPs的UV−vis光谱;(I)在785 nm波长下，Rh@Ag纳米颗粒的热点分布，分别对应于Rh@Ag0.75(I)、Rh@Ag1(II)、Rh@Ag1.25(III)和Rh@Ag1.5(IV)。

　　（2）DON毒素的双模式LFIA检测（图3）：为获得最佳检测性能，系统地优化了双模态LFIA的关键参数。最佳条件下，在T线处的比色和SERS信号显示出明显的“开/关”模式，支持双信号读出的可行性。与常见霉菌毒素的比较分析表明检测体系对DON具有高选择性。计算得RASPs的抗体标记效率为99.1%，其结合常数(ka)为1.85×10⁶ M⁻¹，高于Rh@Ag NPs(7.44×10⁵ M⁻¹)和Au NPs(6.15×10⁵ M⁻¹)，表明普鲁士蓝涂层提高了生物相容性并减少了抗体浪费。灵敏度检测结果表明，所构建方法的视觉检测限(vLOD)为0.1 ng/mL，比Au NPs(1.2 ng/mL)灵敏11倍，SERS检测限降低到4.21 pg/mL，比比色检测灵敏2.8倍。同时，研究结果显示方法具有良好的重现性和稳定性。

　　图3(A)CR-LFIA的检测性能(编号1-12分别对应浓度为0、0.1、0.3、0.6、1.2、3、6、9、12、24、30和50 ng/mL的DON);(D)SERS-LFIA的检测性能;(B)CR-LFIA用于DON检测的校准曲线;(E)SERS-LFIA用于DON检测的校准曲线;(C)CR-LFIA的特异性结果;(F)RASPs基SERS-LFIA的拉曼光谱;(G)拉曼信号的稳定性分析;(H)不同DON检测方法的比较。

　　（3）加标回收测试和机器学习分析（图4）：评估了双模态LFIA检测系统在加标玉米和小麦样品中检测DON的适用性。进一步使用比色读数和拉曼信号强度作为数据特征，采用K最邻近法(KNN)混淆矩阵有效区分了不同水平的DON污染，包括低(0.1 ng/mL)、中低(0.5 ng/mL)、中(3 ng/mL)、中高(9 ng/mL)和高(24 ng/mL)，平均预测准确率为98.8%，模型的精确度为0.97.召回率为0.98.显示出强大的分类性能。构建了两层人工神经网络(ANN)，使用多层感知器(MLP)回归模型输出预测浓度，验证了预测值与原始浓度值的一致性，结果表明超过95%的数据点在一致性范围内，相关系数(R²)为0.993.显示出ANN模型在定量分析中的卓越能力。

　　图4使用RASPs-LFIA检测(A)玉米和(B)小麦样品中DON的结果，编号0-11分别代表0、0.1、0.3、0.6、1.2、3、6、9、12和24 ng/mL的DON浓度;(C)小麦和玉米样品中不同浓度加标的DON的拉曼强度;(D)在不同DON污染水平下KNN算法的混淆矩阵;(E)基于ANN分析的样品预测浓度值与原始浓度值的信号响应曲线;(F)基于ANN分析的预测浓度值与原始浓度值的信号响应曲线;(G)用于预测基于RASPs的双模态LFIA检测结果的ANN算法的描述。

　　研究结论

　　本研究针对食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的检测，开发了一种结合比色和拉曼信号的双模态LFIA系统。通过以立方体形铑纳米颗粒为核心，增强了检测的灵敏度和特异性。在铑表面均匀组装银纳米颗粒，形成等离子体热点，显著提升了SERS性能。同时以普鲁士蓝作为拉曼信号分子，提供了生物相容性并减少了样品基质的干扰。利用kNN和ANN等机器学习算法，实现了对DON污染水平的强大分类和预测能力，分类准确率达到了98.8%。未来的研究可集中在纳米材料的优化，多毒素检测的扩展，机器学习模型的改进以及开发便携式实时检测系统，以便在食品安全和环境监测中得到更广泛的应用。

　　论文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c06582