PEG-SQDs荧光探针：槲皮素检测新方法

槲皮素（QT）是一种广泛存在于草药、蔬菜和水果中的生物活性黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒和抗炎等多种药理作用。它还被用于治疗多发性硬化症、认知障碍等疾病，并能减少脊髓损伤后的细胞坏死。目前检测槲皮素的方法包括高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳、拉曼光谱和电化学方法。这些方法虽然有效，但设备昂贵、操作复杂、耗时且需要专业人员。相比之下，荧光法因其简单、灵敏度高、响应快而备受关注。然而，现有的荧光探针大多依赖有机小分子或掺杂金属的量子点，存在稳定性差、合成复杂或潜在毒性等问题。

卫艳丽教授团队开发了一种基于硫量子点（PEG-SQDs）的荧光探针，用于检测槲皮素。该探针通过荧光猝灭现象实现对槲皮素的高灵敏度检测，检测限低至0.014 μM，线性范围为0.100–45.0 μM。该方法具有操作简便、灵敏度高、选择性好等优点，适用于生物流体和保健品中槲皮素的检测。

1、研究结果与讨论

A. PEG-SQDs的合成与表征

图 1 PEG-SQDs的合成及基于荧光传感的槲皮素检测示意图

PEG-SQDs的合成采用一步法。将5.4 g升华硫粉与14.4 g NaOH、一定量PEG-400和100 mL水混合在250-mL圆底烧瓶中。将混合物在75°C油浴中连续搅拌135小时（图1）。反应完成后，溶液颜色从红棕色变为浅黄色后停止反应。超纯水混合物透析24小时，纯化后的产物冷冻干燥24小时，在4°C下保存备用。

图 2 PEG-SQDs的表征

如图2所示，PEG-SQDs的表征结果表明其具有优异的物理化学性质。透射电子显微镜（TEM）图像（图2a-c）显示PEG-SQDs呈球形且均匀分散，粒径范围为1.5-12 nm，平均粒径为7.4 nm。这一结果不仅证实了PEG-SQDs的成功合成，还表明其具有良好的分散性，这对于后续的荧光性能和生物应用至关重要。傅里叶变换红外光谱（FT-IR，图2d）进一步揭示了PEG-400通过氢键成功包覆在SQDs表面，这种表面修饰显著提升了PEG-SQDs的水分散性。此外，X射线光电子能谱（XPS，图2e-f）分析确认了PEG-SQDs中含有元素硫和表面磺酸基团，这不仅证明了其化学组成的独特性，还为其在生物医学领域的应用提供了重要基础。

B. PEG-SQDs的光学特性及稳定性研究

图 3 不同条件对PEG-SQDs光致发光强度的影响

本文利用紫外-可见吸收光谱和光致发光（PL）光谱对PEG-SQDs的光学特性进行了深入研究，结果如图2所示。在紫外-可见吸收光谱中，PEG-SQDs在215 nm处表现出强烈的吸收峰，归因于n→σ*跃迁；而在高浓度条件下，还观察到一个宽吸收峰位于340 nm（图2a）。进一步研究其PL光谱发现，PEG-SQDs的荧光发射随激发波长的增加而发生红移，表现出激发依赖性（图2b）。具体而言，PEG-SQDs的最大激发波长为357 nm，对应的发射波长为453 nm（图2c）。在最佳实验条件下，以硫酸奎宁为参考，PEG-SQDs的相对PL量子产率测定为0.014。

随后，研究团队对PEG-SQDs在不同环境条件下的光致发光（PL）稳定性进行了评估。实验发现，在0.10–0.80 M的NaCl和KCl溶液中，PEG-SQDs的PL强度保持稳定。此外，在pH值范围为3.0–10的溶液中，PL强度变化不大，且在pH 6.0时达到最大值。当温度从15°C升高到50°C时，PL强度略有下降，这可能是由于溶液粘度降低导致的碰撞猝灭增加所致。这些结果表明PEG-SQDs在多种条件下均具有良好的光学稳定性。

C. PEG-SQDs对槲皮素（QT）检测能力研究及作用机制探索

图 4 PEG-SQDs、QT及其混合物的PL发射光谱

为了验证PEG-SQDs对槲皮素（QT）的检测能力，研究者测量了PEG-SQDs、QT及其混合物的光致发光（PL）发射光谱（激发波长为357 nm）。如图4所示，PEG-SQDs在453 nm处发出强烈的蓝色荧光，而加入30 μM的QT后，荧光强度降低了约55%。这表明PEG-SQDs可以作为检测槲皮素的荧光探针。值得注意的是，QT本身在357 nm激发下没有明显的荧光发射，因此可以通过监测PEG-SQDs的荧光强度变化来定量检测槲皮素。

研究者进一步优化了QT的检测条件，确定最佳步骤为：将不同浓度的QT加入2.00 mL PEG-SQDs溶液（0.10 mg/mL，pH 7.0）中，在25°C下静置20分钟，记录激发波长为357 nm的PL光谱。随着QT浓度的增加，PEG-SQDs的PL强度降低，并在0.100–45.0 μM范围内呈现出良好的线性关系，得出QT的检测限（LOD）为0.014 μM。表明PEG-SQDs是一种高效的荧光纳米探针，可用于快速、灵敏地检测槲皮素。

图 5 PEG-SQDs荧光探针对QT的选择性和特异性测试

为了评估PEG-SQDs荧光探针对槲皮素（QT）的选择性和特异性，研究者选择了多种可能共存的物质进行测试。结果表明，只有QT能显著猝灭PEG-SQDs的荧光，而其他物质的影响可以忽略不计（图6）。即使在其他干扰物存在的情况下，QT的荧光响应也几乎不受影响。

此外，研究者通过荧光寿命测量和光谱分析探讨了PEG-SQDs荧光猝灭的机制。结果显示，加入QT后，PEG-SQDs的荧光寿命从1.56 ns降至1.52 ns，表明存在静态猝灭。Stern-Volmer常数KSV为3.43×10⁴ M⁻¹，双分子猝灭速率常数kq为2.20×10¹³ M⁻¹ s⁻¹，远高于分子扩散速率常数。通过数学模型校正后，发现QT的吸收光谱与PEG-SQDs的荧光光谱存在重叠，但排除了荧光共振能量转移（FRET）的可能性。最终确认荧光猝灭机制为静态猝灭与内滤效应（IFE）的协同作用。

D. 槲皮素在实际样品中的检测

为了验证PEG-SQDs荧光探针在实际样品中的应用效果，研究者对人血清、槲皮素补充胶囊和红酒中的槲皮素（QT）进行了检测。结果显示，人血清中未检测到QT，补充胶囊中QT含量为12.6 μM（与标签一致），红酒中QT含量为18.3 μM。进一步的回收率测试表明，不同浓度（5.00、15.0和25.0 μM）的QT在人血清、补充胶囊和红酒中的回收率分别为92.6%–103%、94.0%–105%和98.0%–105%。与HPLC方法比较，本方法在补充胶囊和红酒中QT测定的误差分别为1.6%和4.5%，回收率范围为94.0%–108%，表明该方法能够可靠且有效地检测实际样品中的QT。此外，还对比了本方法与其他QT检测方法，结果表明本方法适用于生物流体、补充胶囊和葡萄酒样品，性能与其他方法相当。

E. 细胞共聚焦成像

为了探索PEG-SQDs作为细胞内QT荧光探针的潜力，研究者使用Mo3.13细胞进行了成像实验，并通过CCK8试剂盒评估了PEG-SQDs的细胞毒性。结果显示，在100 μg/mL的PEG-SQDs浓度下，超过88.7%的Mo3.13细胞存活，表明其低毒性。此外，共聚焦显微镜观察发现，与PEG-SQDs共培养的Mo3.13细胞在405 nm激发下发出明亮的蓝色荧光，说明PEG-SQDs能够快速穿透细胞膜，适用于活细胞成像。

2、创新点

A. 构建了用于槲皮素检测的灵敏纳米荧光传感探针。

B. 线性检测范围为 0.100–45.0 μM，检测限为 0.014 μM，实现了对槲皮素的高灵敏度和高选择性检测。

C. 血清、补充剂和红酒中可准确检测槲皮素。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2024.141618