非标准核酸技术突破——20重检测系统为环境病原监测注入新动能

主要内容

一、 引物干扰难题：

1. 样本前处理的复杂性：传统多重PCR需同时扩增多个靶标，但引物间易形成二聚体或交叉反应，尤其在高通量（如20重）检测中，灵敏度急剧下降。例如，TaqMan微流控阵列卡（TAC）虽能并行检测，但设备昂贵且难以扩展目标数。

2. 环境样本复杂性：废水、土壤等样本中杂质多，DNA提取效率低，且病原体丰度差异大（如抗性基因可能仅存痕量），进一步增加检测难度。

3. 成本与可及性矛盾：现有技术依赖荧光探针或数字PCR，单次检测成本高，难以在资源有限地区推广。

二、 研究方法

技术突破：SAMRS与AEGIS的协同创新

1. 自避免分子识别系统（SAMRS）

SAMRS通过化学修饰标准碱基（A、T、G、C），形成A*、T*、G*、C*。这些修饰碱基能与天然DNA配对，但彼此间结合力极弱，从而减少引物二聚体（图1）。实验显示，使用SAMRS引物的20重PCR中，引物二聚体几乎消失，扩增效率提升50%以上。

图 1. RoleofSAMRSandAEGIS核苷酸inmultiplexPCR设计。（一）StandardDNAprimersinaPCR反应candimerizeandcrossprime，消耗可用的引物和 dNTP。（b） SAMRS 碱基可以战略性地插入 SAMRS 引物序列中，以最大限度地减少引物二聚体的形成。（c） 使用标准 DNA 或 SAMRS 引物在无核酸酶水中使用合成模板对所有 20 个靶标进行 PCR 扩增，显示标准 DNA 引物二聚化，当不存在模板时尤其突出（图 S3 和表 S2-S6）。SAMRS 引物未显示可见的二聚化。（d） 我们的 SAMRS-AEGIS 20 重反应中的第一轮扩增使用在靶结合区含有 SAMRS 碱基的引物，在突出标签区含有 AEGIS P 碱基的引物。这些 SAMRS-AEGIS 引物旨在扩增目标靶标，同时最大限度地减少引物二聚化和非特异性扩增。在扩增过程中包含相应的三磷酸 Z （dZTP）。（e） 第二次扩增反应使用含有 AEGIS P 碱基的引物与第一轮添加的标签区域结合。这些 AEGIS 条形码引物还包含 24-nt 条形码突出端。在这里，AEGIS 碱基由于缺乏与标准 DNA 碱基的配对而阻止了非特异性扩增.AEGIS条形码引物允许在第一轮 PCR 期间对 SAMRS-AEGIS 引物形成的产物进行高度特异性扩增和富集。第二次 PCR 扩增后，样品被纯化、混合并制备用于下一代测序。

2. 人工扩展遗传系统（AEGIS）

AEGIS引入人工碱基对Z-P，与天然碱基完全正交。研究人员在引物5’端添加含Z/P的标签序列，确保二次扩增时仅靶标产物被富集，避免环境DNA的非特异性干扰。

这一设计使检测特异性接近100%。

 3. 两步PCR与纳米孔测序联用

· 第一步：使用含SAMRS和AEGIS的引物扩增靶标，覆盖低丰度目标。

· 第二步：通过AEGIS标签引入样本条形码，结合牛津纳米孔测序（ONT）识别产物。
该策略将检测限降至10拷贝/μL，且单次测序可分析10个样本，成本仅80美元/样本。

 三、 关键实验结果：高效、精准、信息丰富

1. 与TaqMan阵列卡的性能对比

在废水、土壤、粪便样本中，20重检测系统与TAC的阳性一致率（PPA）达90%，阴性一致率（NPA）89%（图2）。尤其在低丰度目标（如蓝氏贾第鞭毛虫G18S）检测中，20重系统灵敏度显著优于TAC。

图2.SAMRS-AEGIS20-plexassay 和 TaqManarraycards （TAC） 在废水、土壤和废水中的比较。（一）SAMRS AEGIS20-plexassays采用高度多重结构进行多靶点检测，而TAC采用高度并行化结构.TAC和SAMRS-AEGIS20-plexassays运行30个样本（10个废水，10个土壤，10个粪便）。（二）显示 TAC 和 SAMRS-AEGIS20-plex.Positivepercentagreement（PPA）和负百分比agreement（NPA）的 Totalassayspositive（+）和negative%（−）forTAC和SAMRS-04-plex.Positivepercentagreement（PPA）和negativepercentagreement（NPA）。TACandSAMRS-AEGIS20-plexin（c） 废水、（d） 土壤和 （e） 粪便样本的单独检测阳性和阴性。Squarecolor表示assayresult，遵循 totalassayresultmatrix 中使用的颜色编码。TACmcr-1assay 无法用于粪便样本

2. 抗干扰能力验证

向废水样本中人工添加隐孢子虫（CR18S）和空肠弯曲菌（GlyA）基因（1-10拷贝/μL），20重系统检测信号强度是传统引物的1.8-7.9倍，且背景噪音降低2.4-4倍（图3）。

图 3.SAMRS-AEGI 和标准DNA20 重测定在废水、土壤和废水中的纳米孔读取结果。

3. 基因亚型与抗性变异解析

通过纳米孔和Illumina双平台测序，研究团队成功识别：

空肠弯曲菌：区分亚种jejuni与doylei，后者与菌血症相关（图4）。

隐孢子虫：发现C. parvum、C. hominis和C. meleagridis的18S rRNA变异（图4）。

抗生素抗性基因：追踪mer-1（粘菌素抗性）和NDM（β-内酰胺酶抗性）的等位基因分布。

图 4.使用 SAMRS-AEGIS 20 重检测试剂盒鉴定的检测靶标的独特共有序列。显示了 （a） STh（大肠杆菌中的肠毒素基因;（b） 隐孢子虫的 CR18S、18S rRNA 基因;（c） hipO，空肠弯曲杆菌中的马尿酸水解酶基因。在检测到 hipO 的每个样本中，该基因被归类为属于空肠弯曲杆菌空肠亚种或空肠弯曲杆菌 doylei 亚种。相应的亚种用黑色方块表示。相应 qPCR 检测的引物和探针位置标记在每个靶标上方。感兴趣的区域将扩展为显示单碱基分辨率。顶部对齐条以颜色显示与一致对齐变化较大的位置，按碱基进行颜色编码，否则显示为灰色

四、应用前景：从环境监测到精准公卫

1. 废水流行病学（WBE）
实时监测废水中病原体与抗性基因，预警疫情暴发。例如，扩展至SARS-CoV-2、登革热等多目标联合监测。

2. 资源有限地区推广
纳米孔测序仪便携且成本低，适合低收入国家现场检测，助力全球抗性基因分布调查。

3. 临床诊断与耐药管理
通过测序数据解析病原亚型，指导精准用药。例如，区分空肠弯曲菌亚种，优化治疗方案。

五、挑战与未来方向

1. 活体微生物检测
当前方法仅检测核酸，无法区分死菌与活菌。未来可结合mRNA或代谢标志物提升准确性。

2. 定量能力优化
现有系统为定性检测，需开发标准化内参或数字PCR联用，实现病原负荷定量分析。

3. 扩展检测目标
研究已验证20重检测，未来可增至50-100重，覆盖更多病原及新兴威胁（如禽流感、寨卡病毒）。

六、结论：开启病原监测新纪元

这项研究通过SAMRS-AEGIS技术与测序平台的创新融合，攻克了多重PCR的技术瓶颈，不仅提升检测通量和准确性，还赋予基因分型能力。其低成本、高灵活性的特点，使其在环境监测、临床诊断及全球卫生安全中展现巨大潜力。随着技术迭代，这一平台有望成为病原监测的“黄金标准”，为遏制抗生素耐药性蔓延和传染病防控提供关键支撑。

参考文献

原文链接:https://doi.org/10.1021/acssynbio.4c00619