DIMERIC：液滴配对策略突破RPA-CRISPR/Cas12a检测的定量瓶颈

CRISPR-Cas系统是微生物适应性免疫的核心机制，通过CRISPR RNA（crRNA）引导的核酸酶（如Cas12a）降解入侵的核酸。近年来，CRISPR-Cas系统在基因编辑、核酸成像和病原体检测（CRISPR-Dx）方面取得了显著进展。CRISPR-Dx因其高特异性、可编程性和易用性，成为一种极具潜力的快速检测工具。其基本原理是利用crRNA识别目标核酸，激活Cas核酸酶进行切割，释放可检测的荧光信号。结合等温核酸扩增（INA）技术，CRISPR-Dx能够实现超灵敏检测。然而，现有的CRISPR-Dx技术大多用于定性检测，而非定量检测，主要归因于下面3点：①两步法：在初始的INA步骤中，反应快速饱和，导致不同量的模板产生相似的终点荧光信号，阻碍了定量结果的获取。②一步法：目标扩增与反式切割同时发生，需要精细优化以平衡动态反应并消除相互干扰，否则会导致检测灵敏度降低。③定量需求：为了实现精确的核酸定量，需要实时监测荧光信号。为应对这些挑战，研究者们尝试了多种策略，包括空间或相分离INA和CRISPR/Cas系统，使用高密度和/或高粘度物质（如蔗糖、甘油或琼脂糖凝胶）来减少反应之间的相互干扰；以及采用数字CRISPR检测方案对目标分子进行绝对定量。然而，这些方法在兼容性方面存在局限性，例如空间分离方案并不适用于数字化方案中使用的大量反应单元。基于此背景，华南理工大学第二附属医院刘大渔课题组开发了一种基于液滴配对策略的数字RPA-CRISPR/Cas12a（DIMERIC）检测技术（图1），通过微流控芯片技术实现INA和CRISPR/Cas反应的空间和时间分离，克服了上述挑战，突破了传统RPA-CRISPR/Cas12a系统在定量检测中的瓶颈。

作为例证，研究以乙肝病毒（HBV）作为检测目标，证明了DIMERIC检测系统具备与商业数字PCR（dPCR）仪器匹敌的定量能力。在5倍梯度稀释的HBV DNA样本，DIMERIC系统显示出良好的线性相关性（R² = 0.99893），且定量结果与dPCR结果高度一致，尽管其测量值略低于dPCR（图2）。这可能是由于RPA反应中酶介导的DNA熔解和引物退火过程受到某些干扰。此外，在24个临床血清样本的检测中，DIMERIC系统的检测结果与qPCR和ddPCR的结果具有良好的一致性（R² = 0.92033和R² = 0.97337）。所有阳性样本（16/24）均被三种方法一致检测到，而所有阴性样本（8/24）均未产生信号，验证了DIMERIC系统的特异性和灵敏度。值得注意的是，DIMERIC系统利用了PAM序列，进一步强化了系统的特异性（图3）。

总的来说，该团队开发的DIMERIC系统通过微流控技术实现了RPA和CRISPR/Cas12a反应的时空分离，解决了传统方法中存在的兼容性问题，并显著提高了检测效率和准确性。该系统能够在20分钟内完成HBV DNA的定量检测，并在临床样本中展现出良好的特异性和灵敏度，为快速、精确的病原体核酸定量检测提供了一种新的解决方案，具有重要的临床应用前景。

图1  DIMERIC的工作流程和原理。利用Y形液滴生成器将RPA master mix（含有DNA样本）和醋酸镁生成130 μm液滴捕获于‘葫芦’结构芯片中的大微坑中，利用共聚焦液滴生成器将Cas12a mix生成80 μm液滴捕获于‘葫芦’结构芯片中的小微坑中，液滴的捕获依靠浮力和油相的拖曳力。15 min RPA（37 ℃）反应后，通过电场作用，将RPA液滴和CRISPR/Cas12a液滴合并，激活CRISPR/Cas12a系统。CRISPR/Cas12a系统切割报告分子（37 ℃），释放荧光信号，用于检测目标核酸的存在。5 min后，利用高分辨率显微镜记录荧光信号。根据泊松分布，实现目标分子的绝对定量。

图2  DIMERIC的定量性能。（A）DIMERIC针对5倍梯度稀释的HBV DNA样本的终点荧光成像图。随着DNA模板浓度的降低，阳性液滴的比例逐渐减少，且在无模板对照（NTC）实验中未观察到假阳性液滴，表明系统的特异性良好。（B）测量的HBV DNA浓度与稀释因子呈良好的线性相关性（R² = 0.99893）。（C）DIMERIC系统与商业数字PCR（dPCR）仪器的的定量结果比较

图3  DIMERIC检测系统的临床验证。（A）HBV基因组图谱，目标序列以灰色突出显示（在聚合酶编码区）。（B）CRISPR/Cas12a检测机制示意图。Cas12a识别的靶点序列（蓝色）和PAM序列（红色）。（C）24个临床样本中HBV DNA的定量结果热图，检测结果与qPCR和ddPCR进行比较。（D）基于DIMERIC的24个临床样本的终点荧光图像。（E）DIMERIC测定的HBV DNA浓度与qPCR测定结果的相关性（R² = 0.92033）。（F）DIMERIC测定的HBV DNA浓度与ddPCR测定结果的相关性（R² = 0.97337）。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117256