“四合一”纳米杂交体：点亮MPXV检测的磁性比色催化SERS新路径

1.引言

猴痘在人际间具有高传染性，且在临床上与天花、麻疹和水痘具有高度相似性（发热、特征性皮疹、淋巴结肿大和肌肉疼痛），因此开发可用于控制传播的快速、准确检测方法极具挑战。然而，传统的LFA依赖于胶体金纳米颗粒(AuNP)，存在比色信号不足、灵敏度差、检测范围窄等问题。表面增强拉曼散射(SERS)作为一种无损、超灵敏和指纹光谱技术，已在LFA中得到广泛研究，但拉曼光谱仪的高成本是SERS检测的瓶颈。因此，将磁性纳米酶与SERS标签结合构建多模态LFA，对于通过独立输出信号的自验证和自校准提高检测结果的可靠性，以及通过模态互补性减少对仪器的依赖，拓宽POCT的应用场景更有意义。

本研究报道了一种基于“四合一”多功能Au/Pt共修饰Fe₃O₄(MS@Pt)卫星纳米复合物的三信号读出LFA(TLFA)，该复合物具有磁性、比色性、催化性和SERS特性。设计中，MS@Pt-DTNB标签引入LFA后，其固体磁响应性允许捕获和富集复杂样品中的目标，有效减少基质干扰。MS@Pt在可见光范围内表现出优异的光学性能，在LFA条带上提供原始的比色结果，用于快速定性。异质结构中的电子转移增强了过氧化物酶样活性，催化底物产生的颜色沉淀物增强了比色性能，从而提高了定性分析的灵敏度。金壳中大量的“热点”提供了优越的SERS活性，DTNB产生SERS信号用于超灵敏的定量检测。通过整合传统比色法、纳米酶辅助增强比色法和SERS三重信号读取，MS@Pt-TLFA能够快速、高灵敏度、准确地对MPXV重组蛋白A29L进行定性和定量检测。

方案1.a)“四位一体”多功能MS@Pt标签的制备和b)用于MPXV定性和定量检测的MS@Pt-TLFA三信号模式示意图。

2.结果与讨论

MS@Pt的表征

高阳离子PEI聚合物介导的AuNPs在Fe₃O₄表面的自组装合成了生长过程所需的种子4。该过程涉及将DTNB编码到Fe₃O₄-Au-DTNB种子表面，作为SERS信号源，通过Au-S键促进。在超声作用下，通过NH2OH-HCl还原HAuCl4沉积在种子NPs表面，形成具有连续纳米间隙的可控Au壳层（MSNPs），从而产生增强的SERS信号。然后以H2PtCl6为Pt源，以NaBH4为还原剂掺入PtNPs提高催化活性。能量色散X射线能谱（EDS）元素映射证实了金属壳层的逐层组装。通过动态光散射（DLS）测量的ζ-势的动力学和流体动力直径的增加，初步验证了每一步产物的生成。MS@Pt成功合成后，饱和磁化强度（MS）值降至29.86emug⁻¹，但仍保持60s内完全富集的磁响应性。

图1.MS@Pt的结构表征。

MS@Pt-DTNB的SERS活性

为了提高定量分析灵敏度，选择DTNB作为比较标准，它在1331cm⁻¹处具有强特征拉曼峰，容易与贵金属结合。随着H₂PtCl₆浓度的增加，Au壳表面的PtNPs增加，阻碍了产生信号增强的纳米间隙，导致SERS强度下降，催化活性增加。Pt前驱体添加量超过400µM后，上述趋势明显减缓。MS@Pt-DTNB标签的SERS强度比MS@Pt显著增强近1.5倍，与MSNPs的SERS强度接近。因此，选择400μMH2PtCl6合成MS@Pt以保持最佳的SERS和催化活性。MS@PtNPs的SERS增强因子（EF）计算为1.542×106。MS@Pt-DTNB标签在乙醇中储存60天后，其分散性和SERS活性无显著差异，且在1000mM高盐环境和宽pH范围内保持稳定。随机选取的4批MS@Pt-DTNB标签的SERS强度保持稳定，RSD<8.39%。这些结果表明，具有稳定和可重复SERS活性的三功能标签可以作为复杂样品的高性能检测工具。

图2.a)不同Pt前体浓度（0µM、100µM、200µM、400µM和600µM）合成的单个MS@PtNP的HRTEM图像。b)相应的SERS信号和催化活性。c)(i)Fe₃O₄,(ii)Fe₃O₄-au-dtnb种子，（iii）MSNPs,(iv)MS@Pt,(v)MS@Pt-DTNB标签的SERS强度。d)MS@Pt-DTNB标签在不同存放时间下的SERS强度。e)（i)不同盐浓度和（ii）不同pH下MS@Pt-DTNB标签的照片。f）不同盐浓度和g)不同pH下MS@Pt-DTNB标签对应的SERS强度。

MS@Pt-DTNB标签的催化性能

催化纳米颗粒的类POD活性在TLFA上放大比色信号中起关键作用。MS@Pt-DTNB标签对pTMB和TMB氧化均表现出明显的紫外吸收峰，表明其具有固有的POD样催化活性。在pH为4.0时，MS@Pt-DTNB对pTMB和TMB的氧化活性最高。ESR光谱显示，MS@Pt-DTNB催化的DMPO--OH信号强度是Fe₃O₄的2.7倍，表明该纳米标签具有较高的类POD活性。动力学研究表明，MS@Pt-DTNB纳米酶对TMB的Vmax和Km均优于Fe₃O₄纳米酶，表明MS@Pt-DTNB具有更高的催化速率和对TMB的酶促亲和力。因此，MS@Pt-DTNB具有增强的类POD活性，可能是由于杂化结构中的电子转移引起的，可以作为催化信号放大的高性能标签。

图3.A)单组分pTMB和MS@Pt-DTNB+pTMB的紫外可见光谱。b)不同浓度MS@Pt-DTNB催化pTMB氧化的紫外可见光谱。c)MS@Pt-DTNB氧化pTMB在不同ph下的pod样活性。在单组分pTMB溶液中加入15μgmL⁻¹MS@Pt-DTNB，测量350nm处的吸光度。d)H₂O₂、TMB、H₂O₂+TMB、MS@Pt-DTNB+TMB、MS@Pt-DTNB+H₂O₂+TMB的紫外可见光谱。e)不同浓度MS@Pt-DTNB催化氧化TMB的紫外可见光谱。f)MS@Pt-DTNB氧化TMB在不同ph下的pod样活性。将10μgmL⁻¹MS@Pt-DTNB加入含有100 mM H₂O₂和1mMTMB的NaAc-HAc缓冲液中，测量652nm处的吸光度。插图：对应样品的颜色变化。g)DMPO-•OH在MS@Pt-DTNB和Fe₃O₄存在下的EPR光谱。h)50mM H₂O₂下不同浓度TMB和i)2 m MTMB下不同浓度H₂O₂下MS@Pt-DTNB和Fe₃O₄的Michaelis-Menten曲线比较

MS@Pt-TLFA的原理与优化

MS@Pt-TLFA检测过程：将MS@Pt-mAb偶联物加入MPXVA29L蛋白溶液中反应，形成免疫复合物，经磁富集、分离、重悬后滴到样品垫上。混合物扩散与T线上的捕获抗体结合，形成肉眼可见的黑色带，用于初步定性C-LFA。具有POD样活性的MS@Pt催化pTMB产生紫色沉淀，得到催化增强比色结果CE-LFA。对T线上1331cm⁻¹处的SERS信号进行定量分析。

C-LFA和CE-LFA均可进行定量SERS分析，不受催化作用的影响。MS@Pt-TLFA系统中的双比色和拉曼信号均与靶MPXVA29L蛋白浓度呈正相关。优化结果表明，2µL单组分pTMB是催化信号放大最适用的体积，磁富集可提高比色定性和SERS定量的灵敏度。

图4.A)阳性和阴性样品TLFA检测示意图。优化b)T线上抗体浓度，c)标签添加，d)MS@Pt-TLFA条带的色谱反应时间。

MS@Pt-TLFA性能评价

在最佳条件下，用PBST缓冲液梯度稀释A29L蛋白评估MS@Pt-basedTLFA条带的检测性能。结果表明，随着A29L蛋白浓度的增加，C-LFA和CE-LFA中T线颜色逐渐加深，且酶催化的放大信号沉积并没有改变浓度依赖的比色定性关系。C-LFA肉眼比色信号的检出限为0.5ngmL-1，CE-LFA肉眼比色信号的检出限为0.005ngmL-1，比前者低100倍。SERS结果显示，T线上SERS信号的分布相对均匀，且与MPXVA29L蛋白呈正相关。MS@Pt-TLFA的定量LOD为0.0016ngmL⁻¹，比基于aunp的LFA的比色结果灵敏312.5倍，比ELSA商用试剂盒的LOD高5.73倍.

MS@Pt-TLFA条在多种病毒干扰下，没有产生与空白组不同的比色信号和SERS信号，说明MS@Pt-TLFA具有良好的特异性。重复性实验表明，C-LFA和CE-LFA中T线的比色信号变化一致，且各组的SERS信号无显著差异，说明MS@Pt-TLFA具有优越的稳定性和重复性。

图5.A)不同浓度MPXVA29L蛋白的C-LFA和CE-LFA条带照片，以及试验区SERS作图图。b)T线平均SERS谱。c)A29L蛋白对应的校准曲线。d)不同浓度MPXVA29L蛋白的基于aunp的LFA条带照片。e)不同浓度MPXVA29L蛋白的ELISA分析。f)根据图5e的检测结果对应的校准曲线。g)TLFA检测MPXVA29L蛋白的特异性。

复杂样品的应用

为验证TLFA的临床应用价值，通过对A29L蛋白加标的PBS缓冲液、血清和咽拭子样品进行回收实验，结果表明，C-LFA和CE-LFA的T线上的比色信号高度相似，SERS反应强度随蛋白浓度降低而下降，且组间无显著差异，可与空白组区分。血清样品的平均回收率为82.65%~97.94%，咽拭子样品的平均回收率为86.61%~107.02%，表明TLFA具有可接受的临床定量精度。

对灭活的MPXV病毒的检测结果表明，与C-LFA相比，纳米酶催化扩增后定性灵敏度提高了30倍。MS@Pt-TLFA的定性和定量灵敏度分别是基于aunp的LFA试纸的10倍和103倍以上。MS@Pt-TLFA对MPXV灭活病毒的A29L蛋白的催化扩增比色定性灵敏度和SERS定量灵敏度分别为2.53pgmL^-1和1.91pgmL^-1，与直接检测A29L蛋白的灵敏度相匹配。这些结果表明，MS@Pt-TLFA适用于复杂临床样品中的病毒POCT检测。

图6.a)不同浓度灭活MPXV病毒的C-LFA和CE-LFA条带照片。b)T线平均SERS谱。c)灭活MPXV病毒对应的校准曲线。d)AuNP-LFA与MS@Pt-TLFA定性定量lod比较。

3.总结

本研究设计了一种使用“四合一”多功能Au/Pt共修饰Fe₃O₄(MS@Pt)纳米标签的三信号模式LFA(TLFA)123.这种MS@Pt-DTNB标签具有优异的磁性、光学、类过氧化物酶和SERS特性，能够输出比色、催化增强比色和SERS信号的三重信号读数，用于磁分离后的猴痘病毒(MPXV)检测。MS@Pt-TLFA可以在35分钟内以宽线性范围检测MPXVA29L蛋白和灭活MPXV病毒。对于定性分析，它提供的比色结果灵敏度提高了100倍和30倍，并且具有超灵敏的定量检测限，分别MPXVA29L蛋白为0.0016ngmL-1，灭活病毒为17.724pfumL^-1。此外，TLFA在血清和咽拭子样品中的回收率为82.65%~107.02%，在复杂的临床样品中具有准确性和重复性。与单模LFA相比，MS@Pt-TLFA提供了更广泛的应用范围，并允许通过三个输出信号的互补性，根据场景需求灵活切换检测模式。这种方法为多模式LFA检测病原菌提供了一种更高效、稳定的POCT策略。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.155995