基于机器学习的比色传感器阵列快速区分检测原奶中多种耐抗生素嗜冷菌

1. 引言

嗜冷细菌是在7℃以下可生长的异质微生物群，假单胞菌和不动杆菌常从冷藏原料奶中分离，能产生热稳定酶破坏乳制品，且抗生素滥用使嗜冷细菌产生耐药性，危害乳制品业，故检测嗜冷菌及其耐药性很重要。传统检测方法有局限，比色检测法因简单、快速、低成本、肉眼可见等优势更有效。金纳米颗粒（AuNPs）为比色生物传感器发展提供良好平台，适体修饰AuNPs检测细菌常见但有缺陷。d-氨基酸（D-AA）是细菌细胞壁肽聚糖成分，细菌可将外源D-AA纳入肽聚糖中，已有D-AA包被的金NPs用于检测金黄色葡萄球菌，基于细菌代谢方法也用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌相关分析，鉴于嗜冷细菌细胞膜代谢模式，可用d-aa修饰的AuNPs检测嗜冷细菌。

本研究报道了一种基于机器学习的快速、经济的比色传感器阵列来鉴定嗜冷细菌。由于其特定的代谢行为，传感器阵列还可以进行嗜冷细菌的抗生素敏感性测试（AST）。首先，D-AA被用来特异性代谢进入细菌细胞壁，而真菌或哺乳动物细胞不能。外源D-AA与AuNPs脱离结合后，AuNPs变得不稳定并聚集在细菌表面。在胰蛋白酶豆汤（TSB）培养基和牛奶样品中实现了四种嗜冷细菌的良好区分。最后，基于D-AA独特的代谢行为，构建了AST的快速检测方法，将Au/D-AA和嗜冷细菌与不同浓度的抗生素孵育。

2.结果与讨论

嗜冷细菌的分离与鉴定

通过BLAST比对嗜冷细菌16srRNA序列，确定其所属属。假单胞菌（23.68%）、克雷伯菌（5.26%）、不动杆菌（26.32%）和黄杆菌（5.79%）为优势菌。利用MEGA7.0软件的邻接法生成4个菌株（分别标记为A、B、C、D）的系统发育树，菌株A与内生假单胞菌相似性99.09%，菌株B与内生克雷伯菌相似性99.65%，菌株C和D分别与约氏不动杆菌和锑黄杆菌相似度均为99.72%。

D-aa功能化AuNPs的合成与表征

通过一锅法合成了d-氨基酸（D-AA）功能化的金纳米颗粒（AuNPs），优化Na了HB₄用量和HAuCl₄与D-AA的摩尔比。研究发现，当NaHB₄用量为80μM、HAuCl₄与D-AA的摩尔比为10:1时，Au/D-AA的颜色由浅红变为亮红，A₆₅₀/A₅₂₀比值逐渐下降，表明最佳合成条件。TEM图像显示合成的AuNPs为球形，直径约3nm。FT-IR光谱检测到D-AA的特征峰，表明AuNPs被D-AA有效包裹。

图1.D-AA修饰金纳米粒子的表征

Au/D-AA比色法检测嗜冷细菌

研究以L-Ala修饰的Au/L-Ala和L-Glu修饰的Au/L-Glu作为对照纳米探针，发现其吸收光谱在孵育后无明显变化，表明嗜冷细菌对D-AA有独特代谢特性。通过考察不同D-Ala和D-Glu摩尔比（1:1、1:2、2:1）合成的Au/D-AA比色响应值，发现2:1混合探针响应值最高。最终选择Au/D-Ala、Au/D-Glu和2:1三种传感器进行后续研究。基于A₆₅₀/A₅₂₀值的线性判别分析（LDA）显示，四种菌株能紧密组合且无重叠，表明传感器具有强细菌识别能力。热图显示约翰氏单胞杆菌代谢D-AA能力最强，且2:1传感器响应值最明显。以约翰氏单胞杆菌为模型，验证了传感器的定量分析效果。

图2.Au/D-Ala的吸收光谱

当Au/D-AA与细菌孵育时，D-AA从AuNPs表面分离并被代谢为肽聚糖，导致AuNPs稳定性被干扰，在细菌表面积聚，溶液颜色由红变蓝，吸收光谱峰从520nm移至650nm。实验表明，探针在不含细菌的TSB培养基中稳定，而与嗜冷细菌孵育后，颜色和光谱发生变化，证实AuNPs聚集。约氏单胞杆菌实验显示，2:1探针的代谢差异更大，且细菌更倾向于代谢D-Ala。2:1传感器的吸收光谱峰随细菌浓度增加而红移，A₆₅₀/A₅₂₀值与细菌浓度在10³-10⁷CFU/mL范围内呈线性关系，检测限为10²CFU/mL。

图3.传感器的定量分析效果进行了评价。

快速抗生素药敏试验

研究发现，抗生素可影响细菌代谢行为，进而改变AuNPs聚集程度，因此该探针可用于评估抗生素耐药性。实验表明，单纯抗生素不会引起AuNPs聚集。通过CLSI指定浓度的AST检测，发现内生假单胞菌和内生克雷伯菌对四环素（TET）敏感（MIC为4μg/mL），而约翰氏单胞菌和黄杆菌对TET耐药。热图进一步证实了结果。使用Au/D-Glu和2:1探针也观察到类似现象。此外，Au/D-Ala还用于检测其他三种抗生素（CRO、GM和CIP）的耐药性，结果与肉汤微量稀释法一致，但检测时间仅需6小时，显著提高了效率。

图4.4种嗜冷细菌对不同浓度TET作用后Au/d-Ala的A650nm/A520nm值和热图。

一种用于牛奶中嗜冷细菌鉴定的基于机器学习的比色传感器阵列

研究以D牛奶作为实际样品，分析了不含嗜冷菌的巴氏奶对Au/D-AA的影响，结果表明Au/D-AA在巴氏奶中稳定，吸收光谱无明显变化。通过对接种四种嗜冷细菌的巴氏奶样品分析，Au/D-AA传感器显示出良好的准确性和实用性，回收率为94.5%-106.0%，相对标准偏差小于5%。利用传感器阵列对巴氏奶中的嗜冷细菌进行鉴定，LDA结果显示12个不同组别无重叠，表明其能有效区分不同浓度的嗜冷细菌。此外，该阵列还能区分复杂混合物中的嗜冷细菌，包括不同比例和浓度的混合样本。

图5.传感器阵列对4种不同比例的嗜冷细菌的LDA图。

3.总结

本研究设计了一种由AuNPs和两个D-AA比例组成的廉价、准确、快速的比色传感器，用于检测嗜冷细菌和AST。AuNPs的聚集行为导致了不同的比色响应模式，而这反过来又与细菌对DAA的代谢倾向直接相关。4种嗜冷细菌在6h内被成功鉴别并检测出来，与传统方法（24h）相比，显著加快了细菌检测的进度。此外，比色响应模式实现了在牛奶样品中的实际应用。值得注意的是，针对MIC开发了AST联合Au/D-AA的快速方法，满足了从及时诊断到准确药物治疗的广泛临床需求。然而，由于其他嗜冷细菌（如李斯特菌和芽孢杆菌）对Au/D-AA的行为反应研究有限，该技术尚不成熟。尽管如此，它对于快速检测嗜冷细菌和抗生素敏感性有效，可以显著减少细菌感染和抗生素误用造成的危害。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.fochx.2024.101281