CRISPR-Cas12a赋能：新型纳米酶比色传感器，超灵敏猎捕霉菌毒素

1.引言

黄曲霉毒素会引起神经系统紊乱，损害肝脏、肾脏和免疫系统。定期监测谷物中的真菌毒素至关重要。传统的检测方法需要昂贵的设备、样品制备和专业技术人员。因此，开发廉价、快速、精确的即时检测方法至关重要。CRISPR2类系统（Cas12、Cas13和Cas14a）能够识别和切割靶DNA/RNA，从而便于光学检测方法中的信号读出。Cas12a蛋白因其crRNA设计简单、特异性强、适用性广，而被广泛应用于生物传感领域的核酸检测。单原子催化剂（SACs）以金属原子为活性中心，在催化反应中表现出优异的性能。因此，进一步深入研究Fe-N-CSAzymes的催化机理是促进其广泛应用的必要条件。

本研究报道了一种CRISPR-SAzymes，一种新的双酶系统，用于AFB1的敏感检测。该系统基于CRISPR/cas12a介导的Fe-N-C和Fe-Co磁性纳米颗粒（MNPs），产生肉眼可见的鲁棒信号（参见方案1）。首先，通过高温煅烧含Hemin的ZIF-8和Fe-CoZIF前体，合成了具有最佳过氧化物酶样活性（POD）的Fe160-N-C纳米酶和Fe-Co磁性纳米颗粒。Fe160-N-C与Fe-Co结合，构建了用于Cas12a系统的CRISPR比色信号探针。在没有目标物AFB1的情况下，AFB1适配体激活Cas12a的横向切割活性，释放Fe160-N-C到溶液中，催化TMB-H₂O₂体系显色，溶液变为蓝绿色，颜色变化与AFB1浓度成反比。反之，AFB1存在时会抑制CRISPR/Cas12a的激活，Fe160-N-C不释放，无颜色变化。

方案1.CRISPR-SAzymes原理示意图。(A)Fe-N-C酶的合成。(B)Fe-N-CSAzymes和Fe-CoMNPs的合成和修饰。(C)CRISPR-SAzymes传感器的反应原理示意图。

2.结果与讨论

纳米材料的表征

该研究描述了Fe-N-C和Fe-Co磁性纳米颗粒(MNPs)的合成。在合成过程中，Hemin作为铁离子供体，调控局部配位结构。通过在氮气氛中裂解hemin@ZIF-8，将ZIF-8转化为N掺杂多孔碳，血红蛋白分子被还原成分散良好的Fe-Nx催化位点，形成Fe-N-C。血红素浓度增加导致Fe-N-C尺寸增大。Fe-Cozif具有明显的十二面体结构，高温煅烧后Fe-CoMNPs出现表面塌陷，粒度减小。HAADF-STEM显示，Fe160-N-C中铁原子均匀分散，为单原子分布，而Fe320-N-C中既有孤立的铁原子，也有团簇。ICP-MS结果表明，Fe160-N-C分布最优，是单原子Fe-N-C纳米酶最理想的材料。

图1.Fe-N-CSAzymes和Fe-CoMNPs的形态表征。

对N-C和Fe160-N-C的XRD表征显示石墨碳的特征峰，Fe160-N-C中未观察到金属铁或铁化合物的峰，表明铁原子高度分散。XPS分析证实Fe160-N-C成功加载铁，且Fe160-N-C的N1s谱包含Fe-N键的附加峰，表明其在Fe-Nx位点上的催化活性增强。与N-C相比，Fe160-N-C中C-N键的比例明显较低，这是由于Fe-Nx附近的选择性裂解，增强了活性位点的暴露。Fe-CoZIF热解后的XRD谱图显示ZIF-67结构分解，形成钴纳米颗粒。Fe-CoMNPs表现出较强的磁性能。XANES和EXAFS分析表明Fe160-N-C中铁的价态介于Fe²⁺和Fe³⁺之间，配位数为4.2±0.4，表明Fe-N4构型稳定。HAADFSTEM、XANES和EXAFS分析最终支持Fe160-N-C中存在单原子铁。

图2.结构分析

Fe-N-C催化性能的评价

N-C和Fe160-N-C的XRD图谱显示石墨碳的特征峰，Fe160-N-C中未见金属铁或铁化合物的峰，表明铁原子高度分散。XPS光谱分析表明Fe160-N-C成功负载铁，且Fe-Nx位点增强了催化活性。Fe160-N-C中C-N键比例低于N-C，提高了活性位点的暴露。Fe-CoZIF热解前后XRD图谱表明，ZIF-67结构分解并形成钴纳米颗粒。Fe-CoMNPs表现出较强的磁性。XANES分析表明Fe160-N-C中铁的价态介于Fe²⁺和Fe³⁺之间。EXAFS分析表明Fe160-N-C具有稳定的Fe-N4构型。综合HAADFSTEM、XANES和EXAFS分析，证实Fe160-N-C中存在单原子铁。

图3.Fex-N-C的POD活性。

设计可行性论证

该研究通过实验验证了适体激活和AFB1抑制CRISPR/Cas12a的机制，并利用CRISPR/Cas12a介导的纳米酶传感器检测AFB1的可行性。PAGE实验证实，适体、crRNA和Cas12a协同切割P-DNA，而AFB1能与适体结合并抑制CRISPR/Cas12a对P-DNA的反式切割。SGI荧光检测表明，AFB1通过干扰适体-crRNA双链的形成来抑制CRISPR/Cas12a的激活。紫外-可见吸收光谱证实，Cas12a-crRNA和适配体的引入导致Fe160-N-C释放，催化TMB变色，而AFB1的存在会降低吸光度。TEM表征显示，Fe160-N-C均匀分布在Fe-CoMNPs周围，形成类似卫星的结构，且在缺少靶标的情况下，活化的Cas12a会切割3DFe160-N-C/DNA/Fe-CoMNPs复合物的裸ssDNA部分。

图4.(A)CRISPR/Cas12a激活的PAGE分析。(B)AFB1抑制CRISPR/Cas12a激活的PAGE分析。(C)Fe160-N-C和Fe160-N-C/DNA/Fe-CoMNPs配合物上清液催化能力的比较。红线：Fe160-N-C，蓝线：ssDNA-Fe160-N-C，绿线：Fe160-N-C/DNA/Fe-CoMNPs。(D)CRISPR/cas12a介导的纳米酶检测AFB1传感器的可行性实验。

Fe-N-C催化生成·OH的催化机理

该研究通过理论计算探讨了Fe160-N-C催化生成·OH的机理。DFT计算表明，Fe-N4-C模型具有最低的生成能和最高的结构稳定性，是单原子铁催化剂促进H₂O₂生成·OH自由基的潜在催化中心和活性位点。Fe-N4-C催化H₂O₂分解分为4步，其中形成羟基自由基（·OH）是速率决定步骤。在酸性条件下，OH容易吸附质子化氢原子（H⁺），形成·H₂O并自发解吸，实现Fe-N4-C表面的循环再生。差分电荷密度计算表明，Fe-N4-C表面的·H₂O₂和OH的电子分别集中在Fe-N4键周围和氧原子周围。Fe160-N-C在生成·OH方面具有较低的能垒和增强的电荷转移能力，使其在POD应用中具有特殊的性能。

图5.Fe-N-C酶的过氧化物酶催化机理

实验参数优化及分析性能研究

为了优化CRISPR/Cas12a介导的纳米酶传感性能，研究调整了纳米酶浓度、Cas12a与crRNA比例、孵育时间和ssDNA链长度等参数。结果表明，Cas12a与crRNA比例为1:0.5时反应效率最高，最佳孵育时间为60分钟，纳米酶浓度稳定在2mg/mL，且81bp的ssDNA作为连接Fe160-N-C和Fe-CoMNPs的连接体效果更佳。该方法对AFB1的检测在10⁻⁶~1ng/μL范围内线性相关，最低检出限（LOD）为1.5×10⁻⁷ng/μL，比欧盟标准低7000倍以上。特异性实验表明，该传感器对AFB1具有高特异性，稳定性实验证实该比色传感器用于AFB1定量检测具有可靠性。

图6.(A)Cas12a与crRNA浓度比优化。(B)传感器反应时间优化。(C)Fe-N-C纳米酶浓度优化。(D)ssDNA长度优化。(E)不同AFB1浓度反应溶液的紫外-可见吸收光谱。(F)A650nm对不同AFB1浓度的线性校准曲线。(G)AFB1检测传感器特异性对比分析。(H)传感器稳定性研究。

3.总结

本研究设计了一种新型CRISPR/Cas12a介导的纳米酶检测方法，用于高灵敏度和特异性地检测AFB1.该方法将Fe160-N-CSAzymes整合到CRISPR/Cas12a系统中，利用核酸配体识别目标物，激活Cas12a的反式切割活性，释放Fe160-N-CSAzymes到溶液中释放的Fe160-N-CSAzymes在H₂O₂存在下，催化生成·OH自由基，促进TMB氧化为oxTMB，使溶液由无色变为蓝色。Fe160-N-CSAzymes和Fe-CoMNPs纳米复合材料的整合，将传统的CRISPR/Cas分析转化为涉及纳米材料的分析.该方法无需目标预扩增步骤，可在室温下检测目标物，检测限为1.5×10⁻⁷ng/μL，线性范围为10⁻⁶~1ng/μL，优于现有多数AFB1检测方法合成的Fe-CoMNPs可有效替代市售磁珠，降低背景噪音和检测成本。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.154418